作者：冷南，朱平，王彦宏，韩捷，吴振彪，张惠琴，解慧，樊春梅
【关键词】 投药
关键词 :投药，口服;免疫耐受;胶原;关节炎，佐剂性;关节炎，类风湿
摘 要:目的 探讨口服II型胶原蛋白（CII）对大鼠佐剂性关节炎（AA）的治疗作用及给药时间与疗效之间的关系. 方法 在给予完全福氏佐剂（CFA）致关节炎同时及之前或之后2wk开始经口胃饲不同剂量（0.3，3.0，30.0，300.0μg及1.0mg）的CII治疗SD大鼠的AA，疗程均为3mon. 结果 给予CII口服治疗的SD大鼠，AA的关节症状明显减轻（MMAI43.4±21.0vs13.8±15.9，15.1±8.8，19.1±11.4，P&<0.01），病程缩短（101.8±14.5vs34.6±31.1，54.3±31.1，45.4±37.3，P&<0.01），晚期致肢体畸形比例下降（100.0%vs30.0%，33.3%，40.0%，P&<0.01），病程中关节外表现亦减少（80.0%vs26.7%，20.0%，20.0%，P&<0.01）;其中，似以致关节炎前开始治疗的CII-A组疗效更好. 结论 口服CII诱导免疫耐受对大鼠AA有良好的治疗作用;预防性用药，疗效似更佳.此结果为口服CII用于人类类风湿性关节炎的治疗提供了动物实验依据.
Keywords:administration，oral;immune tolerance;collagen;arthritis，adjuvant;arthritis，rheumatoid
Abstract:AIM To investigate the effects of oral administra-tion with type II collagen（CII）in the treatment of SD rats with adjuvant arthritis（AA），and the relationship between the effects and the time to begin giving CII.METHODS Be-fore，after and meantime CFA being injected in the SD rats’feet hypoderm，the CII（0.3，3.0，30.0，300.0μg and1.0mg）was fed to SD times a week for3months.RESULTS Oral administration of CII led to alleviation of inflammatory reaction located at lesion joints（MMAI43.4±21.0vs13.8±15.9，15.1±8.8and19.1±11.4，P&<0.01），delayed onset，obviously shortened the course（101.8±14.5vs34.6±31.1and54.3±31.1，45.4±37.3，P&<0.01），and reduced the in-cidence and the symptoms except joints of SD rats suffering from AA（80.0%vs26.7%，20.0%and20.0%，P&<0.01）.Compared with CII-B and CII-C groups，the effects of CII-A appeared to be better.CONCLUSION Oral CII could cure SD rats’AA.And it appears to be better if the treatment is given as early as possible.The experiment suggests that the CII may be used in treatment of human rheumatoid arthritis（RA）.
0 引言
口服免疫耐受（oral tolerance）是po某种抗原后，机体通过发育完善的肠相关淋巴组织所产生的免疫低反应状态，其产生和维持与多种机制有关［1-4］ .近年来，通过对po耐受机制的进一步探讨，以及po耐受在部分实验性自身免疫病动物模型治疗中的成功实践［5-8］ ，使人们有理由相信，po耐受这种简便易行、低毒安全的治疗方法有可能成为人类自身免疫性疾病极有前途的治疗手段之一.我们用完全福氏佐剂（CFA）致SD大鼠佐剂性关节炎（adjuvant arthri-tis;AA），分别于致关节炎前2wk，同时及致关节炎后2wk开始给予不同剂量的II型胶原蛋白（type II collagen;CII）经口胃饲.观察大鼠AA的发病、持续及致畸情况，并与AA阳性对照组、乙酸治疗组及CII po阴性对照组比较，以探讨po CII在预防及治疗大鼠AA中的作用、用药时机及剂量--疗效关系和CII po后可能产生的毒副作用.
1 材料和方法
1.1 材料
CII制备以牛软骨为原料，用略加改进的文献［9］ 方法提取，并经SDS-PAGE电泳及薄层扫描鉴定，其CII纯度达95%以上.用0.01mol・L-1 乙酸调整已制备的CII至质量浓度分别为0.3，3.0，30.0，300.0mg・L-1 及1g・L-1 ，4℃保存，备用.自我校动物实验中心购入健康雄性SD大鼠130只，6～8wk周龄，体质量150～278（180±30）g.于我科动物室饲养4～7d后，将大鼠随机分为①CII治疗组，共90只，依给药开始时间分为CII-A――致炎前2wk开始治疗组;CII-B――致炎同时开始治疗组;CII-C――致炎后2wk开始治疗组;每组各30只大鼠.CII-A，B，C各组又依每次胃饲CII剂量分为0.3，3.0，30.0，300.0μg及1mg五个小组，每小组6只大鼠;②AA阳性对照组、乙酸治疗对照组、CII po阴性对照组及正常对照组，每组10只大鼠.
1.2 方法
SD大鼠AA模型制备:将卡介苗（兰州生物制品研究所生产，60mg/支）60℃1h灭活后，生理盐水稀释至20g・L-1 ，与等量高压灭菌的不完全福氏佐剂充分研磨至完全包被，配成CFA（卡介苗浓度10g・L-1 ）.取CII治疗组、乙酸治疗对照组、AA阳性对照组SD大鼠，分别于每只鼠左后足跖皮内注射CFA0.1mL（每0.1mL含卡介苗1mg）致炎，诱导AA发生.
1.2.1 po CII诱导免疫耐受治疗方法
用特制胃饲器经食管胃饲CII或乙酸.其中CII-A组治疗开始于注射CFA2wk前;CII-B组治疗与注射CFA同时开始;CII-C组于注射CFA2wk后开始治疗.各组内又依剂量分组，给予CII每只每次量为0.3，3.0，30.0，300.0μg及1mg，3次・wk-1 ，持续3mo.乙酸治疗对照组于注射CFA同时开始给予0.01mol・L-1 乙酸胃饲，每只每次1mL.CII po阴性对照组则仅给予胃饲CII，每只每次300μg，而不予CFA致炎，给药持续时间及频度同CII治疗组.AA阳性对照组仅给予CFA致炎，不予CII及其他治疗.正常对照组不予任何处理.
1.2.2 观察指标及关节炎判断标准
①po CII对SD大鼠CFA注射局部急性期炎症反应的影响，各组SD大鼠于CFA注射后，观察3d内注射侧足爪及关节的肿胀程度，并计算其急性期的关节炎分数（AS）.②po CII对多发性关节炎及关节外病变的影响CFA所致多发性关节炎一般于注射CFA10～14d后开始出现.主要观察各组SD大鼠四只足爪各关节的红肿程度、持续时间、肢体畸形情况及耳、尾、眼部病变的发生率与严重程度.各关节病变按0～4共五 级评分法:0级无红肿;1级关节稍红肿;2级关节轻度红、肿、热;3级关节中度红、肿、热，轻度功能障碍;4级关节重度红、肿、热，严重功能障碍，甚至畸形.关节炎分数（AS）为每只鼠各关节病变分数的总和;各组内所有鼠AS总和的均数，为该组平均关节炎指数（MAI）;每组各鼠AA病情最严重时AS均数为最大平均关节炎指数（MMAI）.计算公式分别如下:MAI=组内各鼠AS总和/该组大鼠的只数MMAI=组内各鼠最大AS总和/该组大鼠只数统计学处理:数据以x ±s表示，采用检验χ2 或t检验比较各组结果.
2 结果
CFA致SD大鼠AA的作用给予CFA致炎的各组SD大鼠均于注射次日出现注射侧足爪红、肿、热，功能障碍等急性炎症表现，约持续3d后逐渐缓解.约10～14d后，开始出现以多发性关节炎为特征的全身性迟发型超敏反应，累及范围可扩大至未注射CFA的足爪，表现为关节局部程度不同的红、肿、热及功能障碍.随病程延长，多发性关节炎可反复出现，严重者可致受累关节明显畸形，活动障碍.部分大鼠可在不同病期于耳、尾部出现数量不等的炎性小节及眼部的反应性角膜炎等关节外症状.
2.1 po CII对CFA致大鼠急性期关节炎症的抑制作用
致炎前2wk及致炎同时给予CII po后，CII-A组及CII-B组大鼠CFA注射足爪的急性炎症程度明显轻于未开始治疗的CII-C组及AA阳性对照组（P&<0.01，Tab1）;与CII-B组相比较，CII-A组炎症程度更轻（P&<0.01）.乙酸治疗对照组与AA阳性对照组情况相似.
2.2 po CII对SD大鼠继发性多关节炎的抑制作用
给予CII po的治疗组SD大鼠继发性多关节病变与AA阳性对照组相比均明显改善（Tab2，3）.与AA阳性对照组比较，无论CII治疗开始于致炎前（CII-A）、致炎同时（CII-B）或致炎后（CII-C），其各组大鼠再次出现的多发性关节炎症均明显减轻，表现为:累及肢体数减少（P&<0.01），累及关节数下降（P&<0.01），MMAI显著降低，且病程明显缩短（P&<0.01）;病程晚期，各组大鼠因1个或数个关节强直和/或畸形导致1个（或1个以上）肢体活动受限的比例亦明显小于AA阳性对照组（P&<0.01）;而乙酸治疗对照组大鼠的病情与AA阳性对照组类似（P&>0.05）;CII po阴性对照组及正常对照组大鼠均健康存活.
对po CII开始时间与大鼠AA治疗效果的观察发现，以致炎前2wk开始po CII治疗的CII-A组疗效似略优于同时或其后治疗的CII-B和CII-C组（Tab1，2，3），表现为与CII-B，C两组相比，CII-A组大鼠急性炎症期的关节炎分数降低，提示其急性炎症程度较轻（P&<0.01）;再发的多发性关节炎累及的关节数明显减少（P&<0.01），病程亦有缩短（P&<0.01）.但三组大鼠的MMAI和晚期关节畸形的比例相差不显著（P&>0.05）.表1 po CII对大鼠佐剂性关节炎急性期炎症的影响(略) 表2 po CII对大鼠佐剂性关节炎的发病和致肢体畸形作用的影响(略) 表3 po CII对大鼠佐剂性关节炎的MMAI和病程的影响(略)
2.3 po CII对AA大鼠关节外症状的抑制作用
po CII可使AA大鼠出现关节外症状的比例减少（Tab4）.部分AA大鼠在病程不同时期，可于耳、尾、眼出现数量不等、程度不一的炎性结节或反应性角膜炎等关节外症状，以耳、尾表现较多.经观察发现，合并有关节外症状的AA大鼠，一般其多发性关节炎累及肢体和关节数亦较多，关节炎程度较重.各组比较，AA阳性对照组大鼠出现关节外症状的比例最高（10/10），且累及两个以上部位的比例达80%（8/10）.而给CII po治疗的CII-A，B，C三组出现关节外症状的比例及出现两种以上表现的比例均明显低于前者（P&<0.01）.但组间差异不明显（P&>0.05）.
3 讨论
类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis;RA）是一种常见的、具有较大危害性和致残性的系统性自身免疫性疾病.病因不清，且自发缓解罕见.目前认为，RA患者体内免疫系统的紊乱，T细胞亚群比例的改变，尤其关节腔内Th1/Th3细胞的失衡可能是RA的主要发病机制［10-13］ .因此，通过一定方法，诱导患者体内可分泌抑制因子的Th3及Th3细胞的增殖，纠正关节腔内Th1/Th3细胞的紊乱，可能是治疗RA的有效途径［11］ .
通过对po耐受机制的研究发现，po耐受的主要机制为诱导Th1细胞功能丧失（失能，anergy），抗原特异性T细胞克隆删除（clone deletion）及诱导调节性T细胞产生，致外周Th1细胞应答抑制，即主动的细胞抑制（active cellular suppression）等［1-4］ .此外，“旁观者抑制”亦可导致免疫耐受的产生［2，5，15］ .po抗原的剂量是诱导不同po耐受机制的主要的决定因素之一［15，16］ .国外学者曾用不同来源的CII po诱导免疫耐受，对RA动物模型和人RA进行实验性治疗和临床观察，并取得了一定疗效［17，18］ .
作为人类RA的动物模型，我们观察了CII po对大鼠AA的治疗作用，并比较了致AA前、同时和之后不同时期给药及给药剂量与疗效之间的关系.结果显示:①po CII对CFA所致局部急性炎症具有明显的抑制作用（P&<0.01），表现为局部炎症减轻，AS降低;②po CII可明显抑制大鼠的继发性多关节炎的关节症状，表现为CII治疗组受累肢体、受累关节数均明显减少;MMAI降低，病程缩短，晚期合并肢体畸形的比例亦减少（P&<0.01）;③po CII可明显减少AA大鼠关节外表现的比例（P&<0.01）;④致病前即开始给予po CII治疗的大鼠，其疗效似好于同时或之后开始的治疗组大鼠，表现为急性期炎症减轻，继发性关节炎累及的关节数及病程均减少或缩短（P&<0.01）;但三组MMAI、晚期致畸比例和出现关节外症状的比例无明显差异（P&>0.05）;⑤乙酸对大鼠AA无治疗作用;CII po治疗的三组大鼠及CII po阴性对照组大鼠在用药的3mo中未出现明显的毒副反应，后者与正常对照组均健康存活;⑥本实验中未观察到po CII剂量与疗效之间的关系，这可能与每剂量组动物数量过少有关.上述结果提示，po CII诱导免疫耐受对CFA所致大鼠AA有良好的治疗作用和一定的预防作用，不但能使AA急性期炎症减轻，还可使其继发的多关节炎及关节外表现受到抑制.此外，我们在同时进行的相关的实验中还发现，多次小剂量po CII可在AA大鼠模型中诱导产生分泌TGF-β的Th3细胞，并对淋巴细胞的增殖反应有抑制作用
［5，9，19］ ，这可能是po CII诱导AA大鼠产生免疫耐受的机制之一.
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