作者：刘军叶，郭鹞，郑振兴，曾桂英，王晋
【关键词】 电磁脉冲
关键词: 电磁脉冲;Fas;FasL;核酸杂交
摘 要:目的 观察电磁脉冲对小鼠脾细胞Fas和FasL mRNA表达的影响. 方法 40只体质量（18±2）g的健康雄性BALB/c小鼠随机分为未照射组（8只）和全身照射组（32只）.小鼠连续2d接受每日25次脉冲的电磁脉冲全身照射，每次照射间隔约2min.于照射后2，4，8和12h分别取2只未照射小鼠和8只照射小鼠的脾脏.采用RNA打点杂交法检测小鼠脾细胞Fas和FasL RNA的表达水平，并对杂交信号进行灰度扫描后计算RNA表达指数. 结果 受电磁脉冲照射后2h，小鼠脾细胞Fas和FasL的RNA表达指数即分别从未照射的0.59±0.26和0.56±0.23升高到0.97±0.25和0.96±0.21，4h又下降至0.75±0.24和0.69±0.22，8h再度上升达最高峰1.22±0.22和1.32±0.50（与对照组相比P&<0.001），于12h时下降至接近正常水平. 结论 电磁脉冲辐照可引起小鼠脾细胞Fas和FasL RNA表达水平波动性升高.
Keywords:electromagnetic pulse;Fas;FasL;nucleic acid hybridization
Abstract:AIM To observe the effects of electromagnetic pulse on mRNA expression of Fas and FasL in murine splenocytes.METHODS Forty male Balb/c mice with body mass of（18±2）g were randomly designated non-irradiation group（8mice）and whole-body irradiation group（32mice）.Mice received irradiation of electromagnetic pulse for two days，25pulses one day with about2minutes interval.Two non-irradiated mice and8irradiated mice were sacrificed and their spleens were removed2hours，4hours，8hours and12hours after irradiation，respectively.RNA dot blotting assay was employed to examine the expression levels of Fas and FasL gene in murine splenocytes.Positive signals were scanned for gray density and RNA expressing index were cal┐culated.RESULTS Compared with control group，the RNA expressing index of Fas and FasL in murine splenocytes in-creased markedly2h after EMP irradiation，0.97±0.25vs0.59±0.26for Fas and0.96±0.21vs0.56±0.23for FasL.However，the RNA expressing index of Fas and FasL de-creased slightly2h later（0.75±0.24and0.69±0.22，re-spectively），then increased to the highest levels（P&<0.001vs control group）8h after irradiation（1.22±0.22and1.32±0.50，respectively），and finally went down at12h to the normal level.CONCLUSION EMP irradiation can cause an undulatory increasing expression of Fas and FasL in murine splenocytes.
0 引言
电磁脉冲（electromagnetic pulse，EMP）源于核爆炸的电磁波，它对电子仪器的破坏作用已为世人所公认，但对其生物学效应尚知之甚少.我们发现，EMP辐照可致离体培养的小鼠脾细胞发生凋亡.Fas及其配体FasL为介导细胞凋亡的一对膜蛋白，FasL与Fas结合可导致表达Fas的细胞发生凋亡.研究表明，Fas-FasL相互作用是机体清除活化T淋巴细胞，维持免疫自稳的重要机制［1］ .为进一步探讨EMP对哺乳动物免疫系统的效应，我们借助核电磁脉冲有界波模拟器照射小鼠的模型，采用RNA打点杂交法观察EMP辐照对小鼠脾细胞Fas和FasL mRNA表达的影响.
1 材料和方法
1.1 材料
电磁脉冲有界波模拟器;Trizol（Gibco公司），DEPC和T4多核苷酸激酶（Sigma公司），［γ-32 P］ATP（北京亚辉公司），寡核苷酸合成于上海生物工程公司.健康雄性BALB/c小鼠，体质量（18±2）g，本校实验动物中心提供.
1.2 方法
40只小鼠随机分为未照射组（8只）和全身照射组（32只）.采用电磁脉冲有界波模拟器对小鼠进行照射，照射参数:自由体位，脉冲半宽340ns，前沿24ns，场强为40kV・m -1 的EMP每日25次脉冲全身照射，每次照射间隔约2min，连续照射2d.照射后2，4，8和12h分别取8只照射小鼠和2只未照射小鼠的脾脏，立即冻存于液氮中.小鼠脾细胞总RNA的提取按文献［2］及Trizol说明书进行.探针标记参照文献［3］进行，小鼠寡核苷酸探针Fas（5′GGAGAATCGCAGTAGAAGTCTGGTTTGCAC 3′），FasL（5′CGGTAGCCACAGATTTGTGTTG-TGGTCCTT3′），β-actin（5′ACACCTTGGTGC-CTAGAGCGGCCCACGATG3′）经T4多核苷酸激酶标记γ- 32 P.RNA打点杂交:将RNA样品与甲酰胺、甲醛、20×SSC按体积比10∶20∶7∶2比例混合后，点样于预处理硝酸纤维素滤膜上，每点上样25μg，重复3张滤膜，点样完毕后经真空80℃烘烤2h固定RNA.预杂交、杂交和放射自显影参照文献［3］进行.对放射自显影X光胶片上的杂交信号进行灰度扫描，以目的基因与相应β-actin杂交信号的灰度比值作为该基因RNA表达指数，即基因表达指数=目的基因信号灰度值/该小鼠β-actin信号灰度值.统计学处理:采用SPLM统计软件包比较各组小鼠Fas和FasL mRNA表达水平的差异，结果用x ±s表示.
2 结果
各组小鼠脾细胞β-actin的表达水平基本接近，EMP辐照对其并没有造成明显影响（Fig1A～C）.正常小鼠脾细胞即表达低水平的Fas和FasL RNA，受EMP辐照后两基因RNA表达均有所增强，以照后2h和8h显著.对杂交信号进行灰度扫描并计算基因表达指数（Tab1）可见，EMP辐照使小鼠脾细胞Fas和FasL RNA的表达水平呈波动性升高.照后2h，小鼠脾脏细胞即增高Fas和FasL RNA的表达水平（分别为对照组的1.66倍和1.72倍），但于4h又有所下降，8h再度上升达到高峰（分别为对照组的2.09倍和2.36倍），之后于12h下降至接近正常水平.其中，照后8h RNA表达水平与对照组相比差异显著（P&<0.001），照后2，4和12h与对照组相比无统计学意义;照后4，12h与照后8h相比也有统计学差异（P&<0.01）. 表1 EMP辐照后小鼠脾细胞Fas和FasL RNA表达指数（略）
Fas/FasL是介导细胞凋亡的重要分子.它们不仅参与了免疫效应细胞杀伤肿瘤细胞以及某些自身免疫性疾病的发病机制［4-6］ ，而且参与胸腺细胞发育过程中的阴性选择以及机体免疫应答过程中活化增殖淋巴细胞数量的调控［7］ .O’Flaherty等［8］ 的研究表明，混合淋巴细胞培养中的T细胞在活化后立即开始表达Fas和FasL，但由于同时表达高水平的FLICE抑制蛋白（FLIP）和抗凋亡蛋白Bcl-2，T细胞在活化后的5d之内并不发生凋亡.到第7日，FLIP蛋白水平大幅度下降，大量的T细胞借助Fas/FasL的相互作用而开始发生凋亡，这即是活化诱导的细胞死亡（Activation Induced Cell Death，AICD）.然而，在Fas表达缺陷的lpr小鼠，活化后的T细胞却不能发生AICD［9］ .提示，Fas/FasL是介导AICD的重要分子，它们对于机体清除过量的已完成免疫效应任务的T细胞、维持免疫系统的自稳态具有重要的意义.有很多研究关注了辐射对机体细胞Fas/FasL表达的影响.Rigberg等［10］ 发现电离辐射可上调食管癌细胞Fas和FasL的表达.Gutierrez Steil等［11］ 发现紫外线照射可上调角朊细胞FasL的表达.Car-icchio等［12］ 用不同剂量的紫外线照射正常人外周血淋巴细胞和Jurkat T淋巴细胞.结果显示，能量大于0.5mJ/cm2 的紫外线均可使受照细胞Fas的表达显著增高.同时，外周血淋巴细胞膜表面FasL数量增多，而Jurkat T淋巴细胞释放可溶性的FasL.由于放线菌酮不能抑制Fas/FasL的升高，提示Fas/FasL的表达上调并不需要新蛋白的合成.
EMP属一种非电离辐射，其生物学效应及防护措施已成为放射医学研究领域一个新的热点.本室的研究表明，EMP辐照可致小鼠学习记忆能力下降和人小肠上皮细胞存活率下降［13，14］ .另一实验还发现，EMP辐照后8h，离体培养的小鼠脾细胞发生了明显的凋亡（另文报道）.为进一步探讨EMP的免疫系统效应，我们采用RNA打点杂交法检测了EMP 辐照后小鼠脾细胞Fas和FasL mRNA的表达水平.结果显示两基因的RNA表达水平呈波动性升高.吴玮等［15］ 用60 Coγ射线照射小鼠，发现小鼠脾脏T细胞Fas的表达在照后2h即明显升高，8h达高峰，12h又逐步下降至正常，而脾脏B细胞Fas的表达在照后2h明显升高，8h却下降为正常的1/3，随后又逐渐上升至24h达高峰.其中，T细胞的反应在照后2，8和12h3个时间点与本研究结果相似，但小鼠脾细胞Fas的表达在受EMP辐照后4h低于照后2h和8h，说明脾细胞对非电离辐射和电离辐射的反应性有所差异.本结果还显示，受EMP辐照后，小鼠脾细胞FasL RNA的表达变化趋势大致与Fas相同，均在照后8h升高到最大值.这与先前观察到的离体脾细胞在EMP照后8h出现凋亡相一致.EMP辐照能否引起在体免疫细胞发生凋亡，还有待于进一步探讨.
我们发现，受EMP辐照后，小鼠脾细胞Fas和FasL RNA表达水平呈波动性升高，提示EMP可能通过影响小鼠脾脏免疫细胞的凋亡从而影响机体免疫功能.
参考文献
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