【关键词】 柔红霉素
关键词: 柔红霉素;视网膜色素上皮;caspase-3;凋亡
摘 要:目的 探讨天冬酰胺特异酶切的半胱氨酸蛋白酶（caspase）成员caspase-3在柔红霉素诱导的人视网膜色素上皮（RPE）细胞凋亡中的变化. 方法 原代培养的人RPE细胞经200μg L-1 柔红霉素诱导8，24和36h后，按照caspase-3荧光检测试剂盒说明处理细胞，再通过荧光比色法间接检测细胞碎片中caspase-3的活性. 结果 正常caspase-3的活性为（0.094±0.005）nmol AFC，8h后增加为（0.446±0.029）nmol AFC，24h后为（0.754±0.056）nmol AFC，36h又下降到（0.486±0.033）nmol AFC，但都高于正常水平（P&<0.01）.加入特异性四肽抑制物DEVD-CHO1μL后活性为（0.040±0.003）nmol AFC，显著低于正常（P&<0.01）. 结论 Caspase-3参与了柔红霉素诱导的人视网膜色素上皮细胞的凋亡，柔红霉素可使其活性增加.
Keywords:daunorubicin;retinal pigment epithelium;cas-pase-3;apoptosis
Abstract:AIM To study the function of caspase-3activity during daunorubicin induced human retinal pigment epitheli-um cell apoptosis.METHODS After being treated with300μmolL-1 daunorubicin for8，24and36h，the primary cul-tured human retinal pigment epithelium cells were treated by following the protocol of a specific assay kit，then the shift of fluorescence emission was detected to determine the activity of caspase-3indirectly.RESULTS The mean activity of the normal group was（0.094±0.005）nmol AFC，and those of induced groups were（0.446±0.029）nmol AFC，（0.754±0.056）nmol AFC，（0.486±0.033）nmol AFC，at8，24and36h respectively.They were all higher than those of normal group（P&<0.01）The four peptides inhibitor-DEVD-CHO decreased the activity to（0.040±0.003）nmol AFC（P&<0.01）.CONCLUSION Caspase-3is involved in daunoru-bicin induced human retinal pigment epithelium cell apopto-sis，and daunorubicin could raise the activity of caspase-3.
近来研究发现，天冬酰胺特异酶切的半胱氨酸蛋白酶（caspases）与凋亡效应器、细胞色素C（CytC）和Bcl-2蛋白家族间相互作用，参与细胞凋亡的调控和执行，是影响细胞凋亡的重要因素.其中caspase-3在凋亡的执行阶段起作用［1］ .以往的研究已经证实，柔红霉素可以诱导体外培养的人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞发生凋亡，癌基因bcl-2和bax参与了对凋亡的调节［2-5］ .但在此凋亡模型中有无caspase-3的参与尚未见文献报道，为此我们进行了以下实验.
1 材料和方法
1.1 材料
DMEM培养基（Gibco公司），柔红霉素（意大利Farmirtalia Cario Erba），caspase-3荧光检测试剂盒（Clontech公司），胰蛋白酶（Gibco公司）.用作者以往报道［4］中3～6代的细胞进行实验.
1.2 方法
将RPE细胞传代接种于75mL培养瓶，待细胞长至约85%时，参照以往实验的条件［2］ ，加入浓度为200μg L-1 的柔红霉素进行凋亡的诱导.实验分组如下:①抑制物组，即不加柔红霉素培养24h，样本处理中加入特异性抑制物DEVD-CHO;②正常对照组，即不加柔红霉素培养24h;③200μg L-1 诱导8h;④200μg L-1 诱导24h;⑤200μg L-1 诱导36h.处理结束后参照试剂盒说明进行酶活力检测，具体程序如下:除正常对照组设5个平行管外，其余每组设4个平行管，每管1×106 个细胞;用50μL细胞裂解液裂解细胞，冰浴10min.细胞裂解物经8500g离心3min（4℃）后收集上清到另一离心管中;抑制物组，即加入2×反应缓冲液50μL（含4mmol L-1 的DTT）和1μL的DEVD-CHO抑制剂到50μL上清，37℃水浴30min，然后进行步骤⑤;加入上述2×反应缓冲液50μL到其他各管;每管中加入1mmol L-1 交联底物5μL，37℃水浴1h.正常培养细胞组中取出1管不加底物用于检测时仪器的调零;荧光比色检测仪检测，激发波长400nm，发射波长505nm，读取数值.实验中采用倒置显微镜常规进行细胞形态的观察.
Caspase-3活性单位的定量:①用细胞裂解缓冲液稀释80μmol L-1 AFC（7-amino-4-trifluoromethyl coumarin，AFC），使终浓度分别为0，0.5，1，2和4μmol L-1 ;②用荧光检测仪测量以上5种浓度的液体，以AFC摩尔数为X轴，荧光单位（fluorescence units，FU）为Y轴，产生AFC标准曲线;③用以下公式计算caspasse-3的活力:caspase-3=FU×斜率-1 ×（nmol AFC FU-1 ）.
统计学处理:数据用x ±s表示，采用ANOVA方法进行统计学处理.
2 结果
2.1 RPE的细胞形态
正常培养的RPE细胞呈现多角形扁圆形或梭形，贴壁生长，悬浮细胞很少.处理结束时对照组细胞呈正常形态，瓶壁接近铺满.药物处理组细胞随着时间的延长，细胞形态变得不典型，细胞折光性变差，部分细胞表面变得粗糙，细胞结构不很清楚，而且细胞密度较正常低，同时悬浮细胞增加.
2.2 caspase┐3活性
8h时已显著高于正常（P&<0.01），24h时最高，36h时有所下降，但仍高于正常（P&<0.01）.标准曲线的斜率为337FU nmolAFC-1 （Tab1）. 表1 柔红霉素对培养人RPE细胞caspase-3活性的影响（略）
3 讨论
近来人们认识到caspases在凋亡中起着重要作用.Caspases为cysteinyl aspartate-specific pro-teinases的缩写，即天冬酰胺特异酶切的半胱氨酸蛋白酶.其中caspase-3（CPP32/Yama/Apopain）在凋亡所需的细胞蛋白水解中起着直接的作用，其水解底物多是细胞中的功能蛋白质，分别参与DNA修复、mRNA裂解、固醇生物合成和细胞骨架重建等［6-9］ .应用检测蛋白水解酶活性的手段可以比其他方法更早检测到凋亡.我们所用试剂盒的原理在于:caspase-3可以裂解交联在底物DEVD上的荧光物质AFC，使其释放，再通过荧光比色法检测反应体系中的荧光强度，间接反映蛋白酶的活性.此方法简便、快速，灵敏，整个过程可以在90min内完成.
我们前期的工作已经证实，200μg L-1 柔红霉素作用24h可以诱导培养人RPE细胞产生凋亡［2，3］ ，因而本实验中采用这一浓度进行诱导.实验结果显示，柔红霉素对细胞形态的影响同我们以往的报道类似，证实实验具有可重复性.在药物诱导8h时，已经有caspase-3酶活性的增加，同未诱导组相比具有显著差异（P&<0.01），到24h时活性进一步增加，而到36h时活性则开始下降，但仍高于正常（P&<0.01）.这一结果证实，caspase-3在柔红霉素诱导的人RPE细胞凋亡模型中起着一定作用.目前认为，在多种细胞凋亡的过程中，bcl-2和bax等癌基因产物可以调节线粒体中CytC的释放，而后者则可以激活caspase-3，进而引起特征性的细胞凋亡变化［10，11］ .我们以往的实验显示，柔红霉素可以促进bax基因的表达，bax通过促进CytC的释放来激活caspase-3.另外bcl-2家族的成员还可以通过其他途径影响caspase-3的激活，从而影响凋亡.实验中我们还发现，caspase-3的活性可以被人工合成的四肽DEVD-CHO特异性的抑制（P&<0.01）. 我们的研究表明，在柔红霉素诱导的人RPE细胞凋亡模型中，有caspase-3蛋白酶活性的增加，即caspase-3蛋白酶参与了这一过程，而其抑制物可以抑制其活化.这提示人们能够通过基因转染［12］ ，人工合成针对某种基因的反义核苷酸［13］ 或合成caspase-3特异性的抑制物和激活物等手段，直接或间接地影响RPE细胞的凋亡，从而治疗与RPE细胞异常凋亡有关的疾病，如增生性玻璃体视网膜病变、视网膜色素变性和年龄相关性黄斑盘状变性等［14，15］ .
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