作者：何远东，费舟，章翔，贺晓生，李树合，梁景文
【关键词】 脑损伤
关键词: 脑损伤;代谢性谷氨酸受体;基因表达;a-甲基-4-羧基苯氨基乙酸
摘 要:目的 研究大鼠加速性弥漫性脑损伤后大脑皮层代谢性谷氨酸受体1a（mGluR
1a ）的基因和蛋白表达变化与其拮抗剂a-甲基-4-羧基苯氨基乙酸（MCPG）的作用. 方法 SD大鼠165只随机分为mGluR1a 变化和MCPG作用2组.每组又分为不同的亚组.采用Marmarou大鼠加速性弥漫性脑损伤模型.在伤后不同时间大鼠断头取脑进行免疫组化，RT-PCR技术和病理学研究. 结果 伤后1h大脑皮层mGluR1a 的表达开始增加，24h达高峰（13.9±2.3） HP-1 ，P&<0.01.在伤后7d，MCPG治疗可使损伤神经元数量明显减少（4.22±1.63） HP-1 ，P&<0.05. 结论 mGluR1a 参与外伤后的神经元损伤，其拮抗剂MCPG可能对脑损伤有治疗作用.
Keywords:head injury;mGluR;gene expression;MCPG
Abstract:AIM To study the change of metabotropic gluta-mate receptor1a（mGluR
1a ）expression in a rodent model of impact acceleration diffuse brain injury and the effect of its antagonist a-methyl-4-carboxyphenylglycine（MCPG）.METHODS 165male SD rats were randomized into two groups:Changes of mGluR1a and effect of MCPG.Each group was repided into different subgroups.After Marmarouou’s rodent model of impact acceleration diffuse brain injury，rats were decapitated as planned and the cere-bral cortex mGluR1a was examined by immunohistochemistry，RT-PCR and the effect of MCPG was examined by pathologi-cal method at different time after injury.RESULTS At1h after injury the expression of mGluR1a increased and the most robust increase occurred at24h after injury in the injured cerebral cortex（13.9±2.3） HP-1 ，P&<0.01.Administra-tion of MCPG reduced total cortical necrotic neurons counts on the7day after injury（4.22±1.63） HP-1 ，P&<0.05.CONCLUSION The change of mGluR1a after traumatic brain injury and the neuroprotective effects of MCPG suggest that the activation of mGluR1a contributes to post-traumatic neuronal damage and that MCPG may have therapeutic po-tential in head injury.
0 引言
谷氨酸（Glu）是中枢神经系统（CNS）主要的兴奋性神经递质，它的兴奋性毒性是导致神经元损伤的重要因素.创伤性脑损伤（TBI）可引起Glu的过量释放［1-3］ ，激活Glu受体并最终导致神经元死亡.Glu通过离子型谷氨酸受体（iGluR）和代谢性谷氨酸受体（mGluR）作用于神经元.但目前的研究主要集中在iGluR，而关于mGluR在脑损伤病理生理中的作用却知之甚少.我们拟在Marmarou弥漫性脑损伤模型基础上，从基因和蛋白水平探讨伤后不同时间大鼠大脑皮层mGluR1a 表达的变化及其拮抗剂MCPG的作用和意义.
1 材料和方法
1.1 材料
健康雄性SD大鼠165只，体质量340～375g，随机分成2组:mGluR1a 变化和MCPG作用2组.其中mGluR1a 变化组又分为免疫组化、RT-PCR及其各自的对照组共4个亚组;每个亚组分损伤后1，6和24h;3，7和14d6个时间点，每个时间点5只大鼠.MCPG作用组又分为假手术对照组、生理盐水（NS）和MCPG治疗3个亚组，每个亚组分伤后1，7和14d3个时间点，每组5只大鼠.大鼠称重后，以20g L-1 戊巴比妥钠溶液ip麻醉（40mg kg-1 ）.立体定向头架固定大鼠头部，正中切开大鼠顶部头皮，在冠状缝与人字缝之间，用高分子聚脂固定一金属圆盘（直径8mm，厚2mm）于顶骨上.将大鼠移置在一个以知弹性系数的海绵上，900g铜棒在一有机玻璃管内由1m高处自由坠落在金属圆盘上，即刻移开海绵及大鼠以免铜棒反弹造成二次击伤［4］ .去除死亡及有骨折的大鼠.假手术对照组无头部坠落伤.MCPG作用组除以上准备外，还要在前囟后1.2mm，左侧1.5mm的顶骨上钻孔，于头部坠落伤后15min行脑室内注射.其中治疗亚组脑室内注射MCPG10μL，而生理盐水（NS）亚组脑室内注射等量生理盐水，注射后立即以骨蜡封闭骨窗.对照组不进行脑室内注射，其余处理相同.同时右侧股动脉插管以检测伤后1h的血压、血气和心率.
1.2 方法
1.2.1 大脑皮层mGluR1a 阳性神经元检测 免疫组化及其对照组中各时间点的大鼠，先行戊巴比妥钠ip麻醉，开胸左心室插管，100mL的生理盐水冲洗后，用500mL含40g L-1 多聚甲醛和饱和苦味酸的0.1mol L-1 的磷酸缓冲液（PB，pH7.3）灌注固定1h.在前囟至前囟后8mm区域内取脑样，置于含300g L-1 蔗糖的PB内过夜（4℃）.冰冻连续冠状切片（厚30μm），隔4取1，收集于PBS内.用ABC法行mGluR1a 免疫组织化学染色.在冠状切片的脑室上皮层区域对称选取两个高倍镜视野作为计数区:左右各一.每个视野面积约为0.26mm 2 .计数区的中心点距皮层上缘0.4mm，距正中裂1.0mm.直接在×200的光学显微镜下进行mGluR1a 阳性神经元定量.mGluR
1a 阳性神经元的数目是总视野内的平均值.
1.2.2 mGluR1a mRNA测定
RT-PCR及其对照组中各时间点的大鼠，先行戊巴比妥钠ip麻醉后，立即断头取脑.将受损皮层组织按Chomczynski等介绍的一步法抽提RNA.总RNA（0.1g L-1 ）10μL，100℃变性2min，5×反应缓冲液4μL，1μL的dNTPs（10mmol L-1 ），Rnasin1μL（40ku L-1 ），oligo（DT）18 1μL，反转录酶（MMLV，0.2ku l-1 ）1μL，0.1mol L
-1 的DTT2μL，置37℃孵育1h，然后在95℃加热5min，-20℃备用.③PCR扩增:取反转录产物2μL，引物［5］ 1μL，dNTP1μL，10×buffer5μL，DEPC h3 O39.5μL，Taq酶（Takara）0.5μL（0.005U L-1 ）.使用PTC-100PCR仪（MJ Re-search）进行热循环.循环条件:93℃1min，56℃30s，72℃1min，循环次数35.各取扩增产物10μL上样于20g L-1 琼脂糖凝胶加溴化乙锭（1g L-1 ）， 3～5V cm-1 电泳，用UVP凝胶成像系统进行检测，并用Labworks软件对各阳性条带的密度进行测定.通过β-actin校正，半定量计算mGluR1a 含量.
1.2.3 MCPG的作用
将MCPG作用组的大鼠在预定的时间点麻醉后开胸左心室插管，100mL的生理盐水冲洗后，用500mL含40g L-1 多聚甲醛（PB，pH7.3）灌注固定1h.在前囟至前囟后8mm区域内取脑样，后固定至少24h，然后顺次脱水、浸蜡、包埋.冠状石蜡切片（5μm），隔4取1，行HE染色.×200显微镜下计数受损神经元.计数区同前.受损神经元的数目是总视野内的平均值.参照Jenkins等
［6］ 的标准判定受损神经元.
统计学处理:各组实验数据均用x ±s表示.在微机上应用SPSS统计软件进行方差分析.
2 结果
伤后1h时，MCPG治疗组和NS及对照组之间生理参数无明显差异（Tab1）.表1 伤后1h生理指标（略）
2.1 mGluR1a 阳性神经元变化 伤后大脑皮层mGluR1a 阳性神经元弥漫性增加，尤以金属盘下区域明显，主要分布在大脑皮层的Ⅰ～Ⅲ层.与假手术对照组相比，损伤组mGluR1a 阳性神经元在伤后1h即有明显增加（9.49±2.7），P&<0.05，到伤后24h达到高峰（13.9±2.3），P&<0.01.随后逐渐减少，伤后14d基本降至对照水平.脑损伤组可观察到mGluR1a 阳性非常明显的神经元顶树突和基树突消失，胞体肿胀，细胞周围间隙明显水肿增大（Tab2）.表2 伤后不同时间大脑皮层阳性mGluR1a 神经元记数（略）
2.2 mGluR1a mRNA表达变化 脑损伤后1h受损皮质区mGluR1a mRNA表达明显升高（P&<0.05），24h mGluR1a mRNA表达达到高峰（P&<0.01），3d表达开始下降，14d基本降至对照水平（Tab3）.表3 伤后不同时间大脑皮层mGluR1a mRNA表达变化（略）
伤后7，14d时NS和对照组之间受损神经元数无显著差异，而MCPG组受损神经元数明显少于NS和对照组（P&<0.05，Tab4）. 表4 伤后不同时间大脑皮层死亡神经原记数（略）
3 讨论
iGluR是与离子通道相耦联的配体门控离子通道.大量的研究已证明iGluR的活化能够造成细胞内Ca2+ 超载，进而导致神经元损伤［7，8］ .mGluR与G-蛋白耦联，可调节离子通道和第二信使生成酶.迄今为止，mGluR已有8个亚型被克隆.根据药理学和结构标准将其分为3类［9］ :mGluR1，5属于Ⅰ类，与PLC/Ca2+ 级联相耦联;mGluR2，3组成Ⅱ类，而mGluR4，6，7，8构成Ⅲ类.已证实神经细胞Ca2+ 超载对继发性脑损伤的加重有重要作用，而我们的实验数据表明在脑损伤后早期，可动员细胞内Ca2+ 的mGluR1a 的基因表达就有明显升高，到伤后24h达到高峰，并持续数天直至伤后第7日才开始明显下降.这表明CNS外伤性损伤能激活编码mGluR1a 的基因，进行转录、翻译、及蛋白合成，提示mGluR1a 参与外伤后的神经元损伤.而伤后mGluR1a 阳性神经元数目的减少很可能同受损神经元死亡后所造成的神经元缺失有关.已有研究表明Ⅰ类mGluR的活化可增加损伤诱导的神经元死亡［10，11］ .其原因可能是mGluR1a 的活化可促进细胞内Ca2+ 的释放，导致Ca2+ 超载，进而造成神经元损伤.所以mGluR1a 表达增加与加重脑损伤引起神经元死亡有关.
在实验中我们还发现mGluR的拮抗剂MCPG可促进伤后神经元的恢复，这与我们早期的研究结果相符［12］ .而它对伤后生理参数无影响，说明MCPG的保护作用不是由药物诱导血液动力学改变所致.其机制可能是由于MCPG是一种mGluR的竞争性拮抗剂［13］ ，能竞争性拮抗mGluR与PLC/Ca2+ 结合，从而减轻神经元中PI水解与Ca2+ 超载.这也从另一方面证实mGluR的确参与外伤性神经元损伤.有趣的是，MCPG直到伤后第7日才发挥明显的神经保护作用，这说明mGluR可能在“迟发性神经元死亡（de-layed neuronal death）”扮演着重要角色.虽然NM-DA受体拮抗剂治疗实验性脑损伤有效，但由于它直接作用于离子通道，干扰突触传递，产生严重的精神副作用，限制了临床使用［14］ .Ⅰ类mGluR拮抗剂除能直接对抗Ⅰ类mGluR激动作用外，还能对抗NM-DA受体激动的作用［15］ .因此Ⅰ类mGluR拮抗剂有希望用于治疗脑损伤.
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