【关键词】 组胺H3，受体
关键词: 组胺H3 受体;AtT-20细胞;促肾上腺皮质激素;G蛋白
摘 要:目的 观察组胺受体激动剂对AtT-20细胞分泌ACTH的影响，并探讨G蛋白在组胺H3 受体信号转导机制中的作用. 方法 选用文献报道的高表达组胺H3 受体的垂体细胞瘤AtT-20作为观察系统，用放免分析法测定给予组胺受体激动剂后各时间点细胞上清液中ACTH分泌量的变化，并观察药物对细胞增殖的影响. 结果 组胺H3 受体激动剂R-（α）-MeHA（0.1μmol L
-1 ）作用8h能明显促进ACTH的释放，释放量为1920μg L-1 ，与同时间对照组（780μg L
-1 ）相比，明显增高（P&<0.01）;H1 和h3 激动剂则无此作用.且R-（α）-MeHA引起CTH分泌的效应能被H3 受体特异性拮抗剂thioperamide所拮抗，而H1 受体和h3 受体拮抗剂均不影响R-（α）-MeHA的效应.R-（α）-MeHA作用8和24h，对细胞增殖无明显影响.用G蛋白失活剂NEM预先处理细胞后，取消了R-（α）-MeHA增强AtT-20细胞ACTH分泌的效应. 结论 特异性激动组胺H3 受体后能引起兴奋-分泌耦联过程，其信号转导过程中有G蛋白的参与.
Keywords:histamine H3 receptors;AtT-20cells;adrenocor-ticotropin;G protein
Abstract:AIM To investigate the signal transduction mech-anism of histamine H 3 receptor.METHODS The adrenocor-ticotropic hormone（ACTH）levels of supernatants on AtT-20cells from the pituitary gland tumor were measured by ra-dioimmunoassay at the given time after histamine agonists were administrated and the effects of R-（α）-methylhistamine on the cells proliferation were observed.RESULTS The H3 receptor specific agonist，R-（α）-methylhistamine increased the release of ACTH in time-dependent manner.It increased significantly after administrated reagents8h which reached1920μg L-1 compared to the control group780μg L-1 .while the H
1 receptor agonist2-methylhistamine and the h3 agonist impromidine were significantly less potent.Further-more，this response was blocked by thioperamide，an H3 re-ceptor specific antagonist，but not by the H1 and h3 antago-nist chlorpheniramine and cimetidine.R-（α）-methylhis-tamine had no significant influence on cell proliferation within24h.Pretreatment with N-ethylmaleimide（NEM）could abolish the effects of R-（α）-methylhistamine on the release of ACTH.CONCLUSION Specific activation of H3 receptor could evoke the excitation-secretion coupling process，and G protein might be involved in the signal transduction.
0 引言
组胺H3 受体是1983年发现的一种组胺受体新亚型［1］ ，作为突触前自身受体和异身受体，广泛分布于中枢与外周多种神经元末梢的突触前膜，负反馈性调节神经递质的释放2，3］ .研究表明，激动H3 受体可调节中枢和外周神经系统多种神经递质的释放［4-6］ .H3 受体是一类对中枢和外周器官活动具有重要调节作用的受体体系.目前，H3 受体信号转导的机制尚不明确［7］ .根据文献［8］的报道，我们利用高表达组胺H3 受体的垂体瘤AtT-20细胞作为观察系统，观察了三种组胺受体激动剂与拮抗剂对细胞分泌ACTH的影响.实验证明，此研究系统灵敏、准确、可靠，可作为研究组胺H3 受体信号转导机制的有效研究系统.并在此基础上，初步探讨了G蛋白在组胺H3 受体信号转导机制中的作用.
1 材料和方法
1.1 材料
垂体细胞株AtT-20购自中国科学院上海细胞生物学研究所（从美国ATCC引进），RPMI1640购自Gibco公司，新生牛血清（NBS）购自杭州四季青生物工程材料研究所，ACTH检测试剂购自天津德普生物技术和医学产品有限公司，H3 受体激动剂R-（α）-Methylhistamine（R-（α）MeHA）购自Sig-ma公司.
1.2 方法
复苏冻存的垂体细胞株AtT-20，以含100mL L-1 新生牛血清的1640培养液接种于培养瓶中，置于950mL L-1 空气和50mL L-1 CO2 孵箱内，24h后换液，以后每2～3d更换1次培养液.一般4～6d长满，以2.5g L-1 胰酶消化后，按1 2或1 3传代.将AtT-20细胞消化分散后，以每孔约2×105 铺于48孔培养板中，给药后按照时间点收集每孔上清液，保持0～4℃条件下离心以去除脱落细胞，将上清液按照试剂盒操作步骤进行放免测定.用放免γ测量仪及系统分析软件进行分析.通过内插法从logit-log标准曲线上计算出ACTH浓度.取1×107 L-1 细胞悬液置于96孔板中，加入含100mL L-1 小牛血清的RPMI1640，静置24h后，换成含50mL L-1 小牛血清的培养液，同时加入10-5 ～10-9 mol L-1 R-（α）-MeHA，分别于8和24h加入MTT5mg L-1 20μL 孔-1 .反应4h后.小心吸弃上清液，加入DMSO100μL 孔-1 ，振荡10min，然后在酶联免疫检测仪上选用波长670和630nm测定各孔吸光度A（OD）值［9-12］ .统计学处理:培养细胞分泌激素以实际测算出的数值表示.数据用x ±s表示.采用SPLM软件进行单因素方差分析.
2 结果
对传代后1～8d的细胞进行观察与拍照.细胞消化分散后呈小而圆形，传代后1d，单个细胞呈梭形或三角形，体积较小，细胞中央隐约可见细小圆形颗粒.2～4d细胞体积逐渐长大，单个细胞呈梭状，岛状，枫叶状，有的呈多角形，呈簇状接合，部分体积较大的细胞开始融合，细胞中央颗粒明显可见.至5～6d，大部分细胞融合紧密，有的已呈现层叠生长，并出现细胞脱落，同时在大片融合细胞的边缘可见新生出的梭状小细胞.至8d细胞脱落明显，个别区域呈大片脱落，原已融合成片的细胞层块中央呈空洞穴状.
2.1 组胺受体激动剂对AtT┐20细胞分泌ACTH的影响
分别在给药后0，1，2，4，8和12h收集细胞上清液检测ACTH分泌量.正常对照组各时间点分泌量变化不大，无统计学意义.R-（α）-MeHA组，在0.1μmol L-1 作用下，随作用时间的延长，从4h起，ACTH即明显增高，至8h达高峰，12h后逐渐降低. 4，8和12h各点与对照组相比，均明显增高（P&<0.01）.而H1 受体激动剂2-methylhistamine（1μmol L-1 ）和h3 受体激动剂impromidine（10μmol L-1 ）对AtT-20细胞的ACTH分泌无明显影响（P&>0.05，Fig1（略））.
2.2 组胺受体拮抗剂对R┐（α）┐MeHA诱发AtT┐20细胞分泌ACTH效应的影响
应用组胺H3 受体特异性拮抗剂thioperamide，在1μmol L-1 能明显拮抗R-（α）-MeHA（0.1μmol L-1 ）的效应;在1μmol L-1 明显抑制R-（α）-MeHA（0.1μmol L-1 ）的效应.而H1 受体拮抗剂chlorpheniramine（10μmol L-1 ）和h3 受体拮抗剂cimetidine（10μmol L -1 ）都不能影响R-（α）-MeHA（0.1μmol L-1 ）的效应（Fig2（略））.
2.3 组胺H3 受体激动剂R┐（α）┐MeHA对AtT┐20细胞增殖的影响
H3 受体激动剂R-（α）-MeHA（1nmol L-1 ～10μmol L-1 ）作用8和24h后，与同时间点的对照组相比，无明显增殖或抑制作用.
2.4 将细胞预先孵育G蛋白失活剂
N-ethyl-maleimide（NEM）10μmol L-1 30min，能取消H 3 受体激动剂R-（α）-MeHA（0.1μmol L-1 ）的效应. 转贴于 3 讨论
迄今，已发现有两种细胞株富含H3 受体，即人胃癌HGT1 细胞［13］ 和鼠垂体细胞瘤AtT-20细胞.我国虽购进此细胞株，但国内尚无AtT-20细胞的实验和研究资料.因此，本研究在细胞培养、生长状态等方面做了较为详细的观察，为今后利用AtT-20细胞开展科研工作奠定了工作基础.
研究表明，我们购进并传代培养的垂体细胞瘤AtT-20细胞具有分泌ACTH的功能，组胺H3 受体激动剂R-（α）-MeHA（0.1μmol L-1 ）能明显促进ACTH的释放，而H1 ，h3 激动剂则无此作用;H3 受体特异性拮抗剂thioperamide能拮抗R-（α）-MeHA引起ACTH分泌的效应，而H1 受体和h3 受体拮抗剂均不能影响R-（α）-MeHA的效应，说明R-（α）-MeHA引起ACTH分泌升高是由H3 受体特异性被激动所引起的.我们不仅在培养的垂体细胞瘤AtT-20细胞上证实了国外学者报道的该细胞具有高表达H3 受体的发现，还对R-（α）-MeHA引起ACTH分泌的原因做了进一步的实验分析.通过细胞增殖试验，我们发现R-（α）-MeHA诱发细胞分泌升高并非由于细胞数目增加，而是引起细胞分泌功能的大大提高，提出了激动此观察系统中组胺H3 受体所引起的是一个兴奋-分泌耦联过程. NEM属巯基烷化剂，在低浓度时，主要选择性作用于PTX敏感的G蛋白，使G蛋白结构内巯基烷基化，从而使G蛋白不可逆性失活，进而阻断细胞信号的转导［14，15］ .本实验结果表明，用低浓度的NEM处理细胞后，R-（α）-MeHA增强AtT-20细胞ACTH分泌的效应被取消，提示激动H3 受体后所引起的兴奋-分泌耦联过程，其信号转导中有G蛋白的参与.
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