【关键词】 原位杂交，
关键词: 骨形成蛋白;颅面部发育;原位杂交
骨形成蛋白（Bone morphogenetic Proteins，BMPs）属于TGF-β超家族，最初从牛的脱矿骨骨基质提取出来，在活体内可诱导异位成骨.但近年来的研究表明，BMPs还是生长和发育中的调控分子.为了探讨BMPs在颅面部发育过程中的表达、区域及变化，为进一步研究颅面部畸形（如腭裂、唇裂、牙齿发育畸形等）的发生机制打下基础，作者检测了BMP2，4在颅面部各组织正常发育中的表达模式.
1 材料和方法
1.1 材料
BALB/c近交系孕鼠在妊娠期第14，15，16日分别被脱椎处死，取胎鼠头部固定于40g L-1 多聚甲醛，常规脱水包埋，作头部冠状切片.
1.2 方法
质粒pSP-65和Bluescript SK分别含有BMP2cDNA和BMP4cDNA片段，分别由美国基因研究所Dr. Wozney和得克萨斯大学JianQuan Feng提供，采用随机物延伸法标记地高辛作为探针.石蜡切片经常规脱蜡至水及0.1mol L-1 PBS后，分别用0.2mol L-1 HCL和蛋白酶K处理，乙醇脱水干燥.42℃杂交20h后，分别用2×SSC，1×SSC，bufferⅠ，bufferⅡ依次充分洗涤.羊血清封闭30min后，滴加抗标记碱性磷酸酶地高辛抗体2h，洗涤后用显色液（bufferⅢ1000μL，左旋米唑0.24mg，NBT4.5μL及BCIP3.5μL）暗处显色2h，TE液中止反应，常规脱水透明封片.
实验对照为除去探针的空白对照及RNase消化对照.阳性对照为已反复证明为有阳性反应的骨肉瘤标本. 2 结果
GD14，BMP2mRNA转录的区域主要位于鼻中隔、下鼻甲、舌体等组织的未分化间充质细胞以及麦克尔软骨前体细胞中（Fig1）.在一些上皮性区域，无论是舌的上皮细胞，还是下颌突的上皮细胞中，表达BMP2mRNA的阳性细胞数目都很少，在牙胚中也未见BMP2的阳性信号，BMP4除了在BMP2阳性表达的区域有表达外，舌、腭、突、舌、下颌突的上皮细胞中BMP4也有散在的阳性着色（Fig2）.GD15，鼻中隔软骨细胞中逐渐出现BMP2的弱阳性信号，在一些分化较好的细胞，如成熟的舌肌细胞中，BMP2，4均无表达.但在一些有软骨细胞形成的区域（如鼻中隔、麦克尔软骨）等处仍有BMP2，4的表达（Fig3）.GD16，麦克尔软骨细胞已形成，分化成熟的舌肌细胞也已构成了舌体的大部分.此时，BMP2，4的表达量均锐减，阳性细胞着色较前明显变浅（Fig4），阳性信号只存在于未分化的间充质细胞中.
3 讨论
近年来的研究表明，在眼、肾、肢体、面突、牙胚、骨骼、神经系统等多种组织和器官的早期发育中也有BMPs的转录［1，2］ .BMPs在胚胎发育中表达的广泛性，提示BMP很可能还是一种信号分子.Vainio等［3］ 研究表明，BMP4在启动牙齿发育中首先表达在牙胚的上皮中，他将含有BMP4的缓释珠与牙胚中的间充质细胞共培养，发现原来无BMP4mR-NA转录的间充质细胞中出现了BMP4的转录.GD14-16为颅面部各组织器官中的未分化间充质细胞由聚集、增殖向细胞分化的转变期，在此期间，未分化细胞向麦克尔软骨细胞以及舌肌细胞分化.本实验结果表明，GD14，在未分化的间充质细胞中BMP2，4mRNA都有表达，但只有BMP4mRNA在上皮细胞中表达.当进入GD15，分化的细胞中基本都无BMPs mRNA的表达.例如，舌肌细胞中不表达BMP2，4mRNA，但未分化的舌肌前体细胞中仍有BMP2，4的表达.表明一旦细胞完成发育，BMPs将不再起促分化作用.而在一些软骨形成区（如鼻中隔、麦克尔软骨），即使未分化间充质细胞向软骨细胞的分化已经完成，其中仍有BMP2，4的强表达，因此此时起使用的可能不仅是BMPs的信号传递作用，其诱骨活性也开始发挥作用.因此，BMP2主要在发育早期起作用，而BMP4在早期和晚期都起作用.
参考文献
［1］Ten Dijke p，Yamadhita H，Sampath TK.Identification of type Receptors for osteogenic protein-1and bone morphogenetic pro-tein-4［J］.J Biol Chem，1994;269（25）:16985-16988.
［2］Dudley AT，Loyons KM，Robertson EJ.A requirement for bone morphogenetic protein-7during development of the mam-malian kidney and eye ［J］.Genes Dev，1995;9（22）:2795-2807.
［3］Vainio S Muller U.Inductive tissue interactions，cell signaling，and the control of kidney organogenesis ［J］.Cell.1997;1990（6）:975-978.