关于考马斯亮蓝微盘比色法测定蛋白质含量

作者：王多宁　赵雁武　田芙蓉

【关键词】 蛋白质测定
　　关键词: 蛋白质测定;考马斯亮蓝;微盘比色法
　　摘 要:目的 建立快速、灵敏的测定蛋白质的方法. 方法 以考马斯亮蓝作为显色剂，用酶联免疫测定仪微盘比色测定牛血清白蛋白和小鼠肝组织匀浆的蛋白含量，并与常量比色法进行了比较. 结果 考马斯亮蓝微盘比色法与常量法相比，对样品的测定结果相近，而前者样品用量少（只需几微升），简便、快速、检测极限低（0.63μg）. 结论 考马斯亮蓝微盘比色法是一种简单、快速、灵敏的蛋白质测定方法，尤其适用于大批量、微量样品的蛋白质含量测定.
　　
　　Keywords:protein assay;coomassie brilliant blue;mi-croplate-colormetric
　　
　　Abstract:AIM To develop a rapid and sensitive method of protein quantification assay.METHODS Protein content of bovine serum albumin（BSA）and mice liver homogenate was determinated by microplate colormetric（MPC）in which coomassie brilliant blue（CBB）is used as color reagent.RE┐SULTS Detecting limit of MPC was lower（0.63μg）than that of macro-colormetric（MC）.MPC had advantage of　rapidity and lesser volume of sample（a few microliter）.CONCLUSION MPC is a method of simplicity，rapidity and sensitivity for protein quantification assay especially suitable for the determination of large number of microliter samples.
　　
　　0 引言
　　
　　生物样品蛋白质含量的测定是许多实验室经常遇到的问题.常用的方法有Lowry氏法和Bradford法［1-4］ （也称考马斯亮蓝法）.考马斯亮蓝（CBB）法由于方法简单，显色剂单一，反应迅速等更被常用.但对于大批量而蛋白质含量又少的样品测定，常量法（MC）测定比较费时、费试剂，且CBB与蛋白质结合物易吸附在比色杯上，不易清洗，重复使用会影响测定结果.因此，我们建立了酶联免疫检测仪微盘比色测定法（MPC）.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 牛血清白蛋白（BSA），上海长阳生化制药厂产品.考马斯亮蓝G-250，Fluka进口分装.其他试剂均为分析纯试剂.DG3022A型酶联免疫检测仪，南京华东电子管厂产品.721分光光度计，上海第三分析仪器厂产品.
　　1.2 方法
　　
　　1.2.1 试剂的配制 标准牛血清白蛋白液:蛋白浓度为0.5g L-1 ，以生理盐水配制.考马斯亮蓝显色液:CBB-G-250100mg溶解在50mL的950mL L-1 的乙醇中，然后加850g L-1 磷酸100mL，放置至室温后加蒸馏水稀释至1L，用滤纸过滤避光保存备用.
　　
　　1.2.2 标准曲线的制作 常量法:在试管中分别加入蛋白标准液:12.5，25，50，75，100，125，150μL（即含BSA分别为6.25，12.5，25，37.5，50，62.5，75μg），然后分别加生理盐水补充使其体积为200μL，空白管加200μL生理盐水，混匀后各加考马斯亮蓝显色液4000μL，摇匀，室温放置5min后，在595nm比色测光密度.微量法:在96孔板中分别加入BSA标准液1.25，2.50，3.75，5.00，6.25，7.50μL（含BSA分别为0.625，1.250，1.875，2.500，3.125，3.750μg），再用生理盐水补充使每孔液体体积为10μL，空白孔只加生理盐水10μL，慢慢摇匀后，分别各加CBB显色液200μL摇匀，室温放置5min后，在酶联免疫测定仪600nm直接测定吸光度.将各自测定的结果作直线回归，并作图. 转贴于 　　1.2.3 样品蛋白质含量的测定 称取小鼠肝组织，用生理盐水制成5g L-1 的匀浆.如有块状不溶物，会造成加样误差，应先以500r min-1 离心5min，然后取上清液测定.
　　常量法测定:在试管中加组织匀浆100μL和生理盐水100μL，混匀后，加CBB显色液4000μL，摇匀室温放置5min后，595nm比色测定.
　　微盘比色测定:在96孔板中加组织匀浆5μL，生理盐水5μL，混匀后加CBB显色液200μL，室温放置5min后，600nm进行微盘比色测定.
　　将所测结果分别用各自的回归方程计算出每毫升匀浆的蛋白含量，并作配对t检验.
　　
　　2 结果和讨论
　　
　　两种测定方法的标准曲线如Fig1，2.在各自的检测浓度范围内，微盘比色法的线性较好（r=0.9958）.
　　
　　图1 － 图2 略
　　
　　配对t检验的统计结果表明，常量法和微盘比色法比较，t=1.2724，P=0.217，n=24，测定结果相近，无明显差异.而考马斯亮蓝酶联免疫测定仪微盘比色法，较常量法相比具有简便，快速，灵敏（常量法检出限为6μg，而微盘法的检出限为0.63μg），样品用量少（只需几微升），节省试剂，结果打印，线性好等特点，是生物实验室大批量微量蛋白质相对含量测定的首选方法，值得推广.
　　参考文献:
　　
　　［1］Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantition of microgram quantities of protein utilizing the principle of pro-tein dye binding ［J］.Anal Biochem，1976;72（1-2）:248-254.
　　［2］Li HB，Li ZR，Wang ZL，Sun LY.Determinations of protein by micro-lowry method ［J］.Shengwuhuaxue Yu Shengwuwuli Jinzhan（Prog Biochem Biophys），1993;20（5）:402-403.
　　［3］Ye QL，Li WZ，Yang LL，Lin DX，Lin S，Chen Y，Lui JC，Lin AZ.The CBB-SDS method for quantitative micro-analysis of protein ［J］.Linchuang Jianyan Zazhi（J Clin Lab Tech），1986;4（3）:120-121.
　　［4］Guo ML，Jiang YM.Effect of ingredients of coomassie brilliant blue color-develop in regent on protein ［J］.Shengwuhuaxue Yu Shengwuwuli Jinzhan（Prog Biochem Biophys），1996;23（6）:558-561.转贴于