作者：程宏伟，张立藩，冯汉忠，程九华，余志斌
【关键词】 失重模拟
关键词: 失重模拟;大鼠;心肌/细胞学;钙;膜片钳;受体，肾上腺素能β
摘 要:目的 研究模拟失重大鼠心肌细胞钙电流（ICa ）对β-肾上腺素受体激动剂的反应性变化. 方法 用尾部悬吊大鼠模型模拟失重（4wk），胶原酶分离心肌细胞，用膜片钳全细胞方式记录单个心肌细胞的膜电容和I Ca 等.给予β-肾上腺素受体激动剂（异丙肾上腺素），记录观察ICa 的反应性. 结果 对照组与悬吊组的ICa 密度无明显差别（P&>0.05），ICa 电流密度-电压曲线基本一致;加入异丙肾上腺素后，两组ICa 密度均明显增大，但是两组的增加幅度不同，悬吊组的增加幅度（84.3±8.2）%明显小于对照组（109.3±7.9）%（P&<0.05）. 结论 模拟失重4wk大鼠心肌细胞的ICa 密度无明显改变;模拟失重后心肌细胞ICa 对β-肾上腺素受体激动剂的反应性降低.
Keywords:weightlessness simulation;rats;myocardium/cy-tology;calcium;patch-clamp techniques;recep-tors，adrenergic，beta
Abstract:AIM To investigate the changes of responsiveness of calcium currents（I
Ca ）toβ-adrenergic receptor agonist in cardiac myocytes of simulated ightless rats.METHODS The rat tail-suspension model was used to simulate weight-lessness（4wk）.Cardiac myocytes were isolated with colla-genase.Under whole cell recording mode of patch clamp technique，membrane capacitances and I Ca were recorded from the single ventricular myocytes.The responsiveness of I Ca was observed after stimulation by aβ-adrenergic receptor ag-nist（isoproterenol）.RESULTS I Ca densities did not show significant difference between control and suspended groups（P&>0.05），and their ICa density-voltage curves were almost same.After isoproterenol was added，I Ca densities were obvi-ously increased in both control and suspended groups，but their increase percentages were not equal.The increase per-centage of I Ca density in suspended group（84.26±8.22）%was significantly less than that in control group（109.3±9.9）%（P&<0.05）.CONCLUSION It is suggested that ICa densities of cardiac myocytes have no obvious changes in4wk simulated weightless rats.Responsiveness of I Ca toβ-adrener-gic receptor agonist significantly decreases after simulated weightlessness.
0 引言
关于失重/模拟失重下心血管系统β-肾上腺素受体反应性的变化，文献报道结果不甚一致［1-3］ .在评定心血管系统β-肾上腺素受体的反应性时，大多数文献均是在体条件下以心率等为指标，而我们知道β-肾上腺素系统在心肌兴奋与收缩的调制中起着非常重要的作用［4］ ，β-肾上腺素受体激活可引起心肌细胞内向钙电流增加，起到正性肌力作用.心血管系统β-肾上腺素受体的反应性还应该表现在心肌收缩力及与之有关的心肌细胞钙电流的变化上.本实验旨在研究模拟失重4wk大鼠心肌细胞钙电流对β-肾上腺素受体激动剂的反应性变化，并观察模拟失重对心肌细胞钙电流的影响.
1 材料和方法
1.1 模拟失重大鼠模型
采用尾部悬吊大鼠模型模拟失重.体质量200g左右的雄性SD大鼠，按体质量配对分为对照组与悬吊组各10只.尾部悬吊按文献［5］ 方法进行，动物在悬吊期间，始终保持-30°头低位及后肢悬垂不荷重状态，悬吊4wk后进行实验. 1.2 单个心室肌细胞的分离 以戊巴比妥钠ip麻醉大鼠，快速打开胸腔，剪下心脏，置于4℃的Joklik MEM（minimum essential medium，Sigma，USA）溶液（加入10mmol・L -1 NaHCO3 和10mmol・L1 HEPES，pH7.2，通以950ml・L-1 O 2 和50ml・L-1 CO 2 的混合气体）中停跳.将心脏经升主动脉连接悬挂于Langendorff装置上，恒压灌流（灌流液柱高度维持在65cm左右）［6］ .流程为［7］ :①上述Joklik MEM溶液（37℃）灌流3min.②含0.5g・L -1 Ⅰ型胶原酶（Sigma，USA）和1g・L-1 BSA（Sigma，USA）的上述Joklik MEM溶液（32～33℃）循环灌流35～40min.③上述Joklik MEM溶液（室温）灌流3min.取下心脏，剪取左室游离壁部分的心肌，在含10g・L-1 BSA的上述Joklik MEM溶液中剪碎、分散，过滤得到单个心室肌细胞悬液.室温下保存，40min内逐步恢复细胞外Ca2+ 浓度至1.8mmol・L-1 ，6～10h以内进行实验［8］ .
1.3 溶液［9］
正常细胞外液组成为（mmol・L-1 ）:137NaCl，5.4KCl，1MgCl2 ，1.8CaCl2 （Sigma，USA），10glucose，10HEPES（Sigma，USA），以NaOH调pH至7.4.无钠细胞外液为，以等摩尔浓度的氯化胆碱（Sigma，USA）替代上述正常细胞外液中的NaCl，以KOH调pH至7.4.电极内液的组成为（mmol・L-1 ）:150KCl，1MgCl2 ，5HEPES，10EGTA（Sigma，USA），5Na2 ATP（Sigma，USA），以KOH调pH至7.2.
1.4 电生理学记录方法
膜片钳实验由计算机、pCLAMP软件（Version8.0，Axon，USA）、数据采集卡（Digidata1200，Axon，USA）和膜片钳放大器（CEZ-2300，Nikon Kohden，Japan）组成的计算机化系统控制完成.整个实验过程中，细胞外液均通以100%O2 ，以2mL・min-1 的流量持续灌流标本槽内细胞.实验在室温（21±2）℃下完成.
在细胞贴壁后，以正常的细胞外液灌流细胞.电极电阻为2～5MΩ，微电极与细胞膜形成巨阻封接后，补偿电极电容，随后以负压吸破细胞膜，形成全细胞记录状态.在此状态下测量细胞膜电容，然后补偿膜电容.
以含3mmol・L-1 4-氨基吡啶（4-AP，Sigma，USA）的无钠细胞外液灌流细胞3min.细胞外液中不含Na+ ，可屏蔽钠电流;4-AP可阻断Ito .给予电压钳制，保持电位为-70mV，除极测试脉冲分别以10mV递增幅度至不同膜电位水平（-50～+60mV），脉宽300ms，脉冲间隔10s，此时可记录到一内向电流，此电流可被CoCl2 阻断，说明该电流为CoCl2 敏 感性的I Ca .接着给予0mV除极测试脉冲，记录ICa .在上述含3mmol・L-1 4-AP的无钠细胞外液中加入1μmol・L-1 的异丙肾上腺素，灌流细胞3min，给予0mV除极测试脉冲，再次记录全细胞膜I Ca .I Ca 的测量是以内向电流的峰值与除极脉冲末段稳态电流的差值作为其幅值，电流密度为电流幅值与细胞膜电容的比值.
统计学分析:以SPSS9.0（Chicago，SPSS Inc.）软件进行数据的统计学分析，包括一般统计量的计算和团体t检验等.数据x ±sx 表示.
2 结果
2.1 I Ca 密度的改变 对I Ca 作电流密度-电压曲线（Fig1）.可见，对照组与悬吊组的I
Ca 电流密度-电压曲线基本一致，两组间无明显差别（P&>0.05）.ICa 有明显的电压依赖性，除极电压正于-40mV时ICa 被激活，除极电压至0mV时I Ca 最大.除极电压为0mV时，对照组和悬吊组左室游离壁细胞I Ca 密度分别为（-8.6±1.1）、（-8.1±1.1）pA/pF（各组n=9个细胞）.结果表明，模拟失重后心肌细胞I Ca 密度无明显改变.
2.2 I Ca 对β┐肾上腺素受体激动剂的反应性 由ICa 的电流密度-电压曲线（Fig1）可知，当除极刺激脉冲为0mV时，I Ca 最大.对β-肾上腺素受体激动剂的反应性，当异丙肾上腺素浓度达到1μmol・L-1 时，I Ca 可达到最大值［10］ .因此我们给0mV的去极化刺激脉冲，在细胞外液中加入1μmol・L -1 异丙肾上腺素的前、后分别记录I Ca （Fig2），观察对照组与悬吊组心肌细胞I Ca 对β-肾上腺素受体激动剂的反应性.
Ca 对β-肾上腺素受体激动剂的反应性降低.
3 讨论
有工作表明，模拟失重4wk大鼠心肌收缩性能明显降低［11］ .多种因素和环节可影响心肌细胞的收缩性能，其中跨膜钙电流的改变是影响心肌收缩性能的重要因素之一.然而，本实验未发现模拟失重后I Ca 密度大小及电流密度-电压曲线特征的明显改变.此结果提示，模拟失重4wk大鼠心肌收缩性能降低并非细胞膜钙内流减少所致，可能另有其它原因.
我们发现模拟失重4wk大鼠心肌细胞ICa 对β-肾上腺素受体激动剂的反应性显著降低.Convertino等［1］ 认为，失重/模拟失重可引起血浆肾上腺素水平降低［12-14］ ，因此为适应此变化，β-肾上腺素受体可能会出现超敏感性反应.为了进一步证实此假说，他们由静脉输注异丙肾上腺素观察心率和血管舒张反应，结果表明14d卧床可引起被试者心血管系统的β-肾上腺素受体反应性增强.然而，也有与此相矛盾的文献报道，如实验发现失重/模拟失重后血浆肾上腺素水平不变［3］ ，被试者头低位卧床后，肾上腺素引起的 心率增快反应无明显变化［2］ 等.因此，关于失重/模拟失重下心血管系统β-肾上腺素受体反应性的变化，目前尚无一致结论.
β-肾上腺素受体激活后，除了具有正性变时作用外，而且还有正性变力作用.心脏中有β1 和β2 受体，β2 受体主要与心脏变时作用有关，而β1 受体主要与心脏变力作用有关.正性变力作用的机制是通过对Ca2+ 通道电流进行调制［4］ :β-肾上腺素受体激动剂与细胞膜上的相应受体相结合，激活Gs蛋白，Gs蛋白引起Ca2+ 内流增加又通过两条途径，一条是cAMP依赖性途径，即Gs激活腺苷酸环化酶，使胞内cAMP浓度增高，cAMP激活蛋白激酶A（PKA），PKA磷酸化钙通道，明显增加Ca 2+ 通道的通透性，Ca2+ 内流增多;另一条是cAMP非依赖性途径，即Gs直接刺激Ca2+ 通道，引起Ca2+ 内流增加，实现对心肌的正性变力作用.因此，心血管系统β-肾上腺素受体反应性不仅表现在心率等的改变，而且还应该表现在心肌收缩力及与之有关的心肌细胞钙电流的变化上.
本实验的结果表明，模拟失重4wk大鼠心肌细胞I Ca 对β-肾上腺素受体激动剂的反应性显著降低.失重/模拟失重后，心血管系统处于低动力状态，心脏负荷减小［15］ ，心脏做功无需很大即可完成泵血功能，因此，I Ca 对β-肾上腺素受体激动剂反应性的降低可能是对心脏负荷减小的一种适应性改变.
模拟失重后，ICa 对β-肾上腺素受体激动剂反应性的降低可能涉及以下环节［10］ :β受体减少;激动剂与β受体的亲和力减弱;G蛋白偶联异常;腺苷酸环化酶活性降低;PKA的磷酸化作用异常;钙通道的改变等.若要阐明I Ca 对β-肾上腺素受体激动剂反应性的降低具体是由于哪个环节改变而引起的，尚需进行进一步的实验研究.
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