作者：毕辉 杨浩 杜亮 胡三觉
【关键词】 胶质源性神经营养因子
关键词: 胶质源性神经营养因子;神经节，脊;海人藻酸;神经毒素类;细胞培养
摘 要:目的 应用体外培养海人藻酸（KA）兴奋性毒素损伤的细胞模型，研究GDNF对损伤的背根节神经元的不同作用，为进一步研究GDNF对神经元作用机制，表达产生及检测方法提供思路. 方法 采用原代培养的方法，用N1无血清分离培养背根节神经元，再用5μmol L-1 KA作用6～8h，加上含有GDNF的无血清培养基，继续培养24h，然后用MTT法检测反映细胞的活性，胎盘蓝染色记数、细胞总蛋白测定以及形态学观察突起的生长状况. 结果 ①细胞活性A值:GDNF+KA（0.0328±0.006），KA（0.0285±0.0075），GDNF（0.0398±0.002），Blank（0.041±0.002）（P&<0.05）;②活细胞数相应为GDNF+KA（60±4.4），KA（35.7±2.2），GDNF（59.3±3.6），Blank（57.7±2.9）;③细胞的总蛋白分别为GDNF+KA（70.3±9.2）（P&<0.01），KA（49.0±3.7），GDNF（75.0±7.3），Blank（68.0±5.5）（P&<0.01）;④突起长度:实验组与对照组不明显，GDNF组与空白对照组不明显. 结论 在正常无血清体外培养情况下GDNF对DRG神经元作用不明显，在KA兴奋性毒素损伤后，对细胞的活性、存活及总蛋白合成有明显的保护作用，但对突起的生长则没有明显的促进作用.
Abstract:AIM To study the different effects of glial-de-rived neurotrophic factor（GDNF）on injured dosal root gan-glion（DRG）neurons using injurious model of neurons in-duced by kainic acid in vitro，so as to provide new thoughts for studying functional mechanism，expression pattern，and bioassay methods of GDNF.METHODS Primarily cultured DRG neurons were dissected from neonatal rats in N1serum-free medium，and then kainic acid medium was added into cul-tures at the final concentration of5μmol L-1 and incubated for6～8h.The next step was performed to culture in DF12serum-free medium supplemented with GDNF for24h.Eventually，MTT was used to test viability of cells by value.Trypan blue staining cell count and total protein of neurons were determined.DRG neurons were observed to detect the neurite length.RESULTS ①A values for viability of cells:GDNF+KA（0.0328±0.006）;KA（0.0285±0.0075）;GDNF（0.0398±0.002）;Blank（0.041±0.002）.②Cell count:GDNF+KA（60±4.4）;KA（35.7±2.2）;GDNF（59.3±3.6）;Blank（57.7±2.9）.③Total protein of cells GDNF+KA（70.3±9.2）;KA（49±3.7）;GDNF（75±7.3）;Blank（68±5.5）（P&<0.05;P&<0.01）.④Neurite length:Remarkable differences existed neither between ex-perimental groups and control groups，nor between GDNF groups and Blank.CONCLUSION GDNF has no distinct ef-fects on DRG neurons in normal serum-free condition in vit-ro，whereas it significantly promotes viability，survival，sythesis of total protein of DRG neurons after kainic acid-in-duced injury.No remarkable promotions occur to outgrowth of neurite.
0 引言
胶质源性神经营养因子（glial-derived neu-rotrophic factor，GDNF）是一种在体有广泛表达并且作用复杂的一种神经营养因子，随着机体的发育阶段以及部位的不同，它的作用也不尽相同，特别是对中枢及外周的神经元的作用表现十分不一致.在离体培养的情况下GDNF具有明显的刺激中枢及外周神经系统许多部位神经元的存活，活性及突起的生长［1-3］ ，但是这种营养作用在正常情况下对背根节神经元（dosal root ganglion，DRG）神经元不敏感.GDNF对DRG神经元是否有作用，一直是大家争论的热点，我们采用兴奋性毒素海人藻酸（kainic acid，KA）损伤的体外培养模型，研究了损伤情况下GDNF对DRG神经元的作用，为研究GDNF的潜在作用及在机体神经损伤修复和功能恢复中的应用提供理论依据，同时为检测GDNF活性提供了方法.
1 材料和方法
所用动物由本校实验动物中心提供.实验分组采用随机分组.
1.1 DRG神经元的培养 采用原代分离培养的方法，在无菌条件下暴露SD新生大鼠2～3d的椎管和椎间孔，分离背根节，剔除血膜，将其放入D1-SGH液（D1为无Ca2+ Mg2+ 的pucks液，SGH为蔗糖-葡萄糖-HEPES溶液）中清洗2次，移入12.5mg L-1 胰酶+12.5mg L-1 胶原酶+2mg L-1 EDTA的复合消化液中，在37℃，50mL L-1 CO2 培养箱中作用35min，然后于300r min-1 离心3min，弃去消化液，加入终止液作用8min，然后用含有N1的DF12培养液将其制成单细胞悬液，分别以1×107 L-1 ，5×107 L-1 的密度分别接种在96孔和24板孔中，培养24h后每孔加入KA，终浓度为5μmol L-1 .同时设立对照组，再于CO2 培养箱中继续培养6～8h一次，然后加入10μg mL-1 的GDNF继续培养24h，然后进行细胞活性总蛋白合成以及形态学检测.
1.2 MTT比色微量分析 参照Mosmenn［4］ 方法，在终止实验前，每孔加入10μmol L-1 MTT［3-（4.5-二甲基噻唑-20YL）2.5-二甲基四唑嗅盐，Sigma产品］继续培养4h，弃去培养液，然后每孔加入1×10-4 L DMSO（二甲基亚砜）溶液，再用加样器反复吹打，使MTT反应的蓝色结晶充分溶解，最后放在Dynatech MR4000型微板读数仪上测A值，实验检测波长570nm，参考波长630nm.
1.3 形态学观察及活细胞记数 用OLYMPUS IX-70型倒置相差显微镜分别观察实验组及对照组DRG神经元的形态变化，并且照相记录;活细胞记数:将实验组及对照组的细胞用20mg L-1 胎盘蓝染色5min，每孔随机选择10视野（每个视野的面积为0.12mm2 ）进行活细胞记数，比较两组活细胞数差异.
1.4 细胞总蛋白测定 将同一批细胞在实验结束前，弃去培养液，每孔加入0.2mL10g mL-1 SDS置于100℃湿盒中作用30min，使细胞彻底裂解，再取Bio-Protein检测液（Bio-RAD产品）2×10-5 L与6×10-5 L细胞裂解液混合室温放置10min，同时以BSA（1～50μg）为标准品用Dynatech MR4000可见 光光度计595nm波长测定溶液的吸光值，以溶液为空白对照，最后绘制标准曲线，依据标准曲线推算样品中的蛋白含量.
所有结果采用x ±s统计.
2 结果
2.1 MTT法检测细胞活性A值 用MTT比色微量分析检测不同实验组之间的神经元，结果发现，实验组GDNF+KA组与对照组之间有比较显著的差异（P&<0.05），而未损伤组之间（GDNF组与Blank组）无显著性差异（Fig1）.
图1 略
2.2 活细胞计数 选择10个视野用胎盘蓝染色计数结果经统计学处理，实验组GDNF+KA组与对照组KA之间的差异有显著意义（P&<0.01）.而未损伤组之间（GDNF组与Blank组）无显著性差异（Fig2）.
图2 略
2.3 DRG神经元的总蛋白合成 实验组与对照组之间，GDNF+KA与对照组KA之间差异有非常显著的意义（P&<0.01）.未损伤组之间（GDNF组与Blank组）也没有显著性差异（Fig3）.
2.4 DRG突起形态观察 GDNF+KA，KA组之间的突起长度不明显.同时GDND组与Blank组之间也不明显（Fig4）.
新生大鼠的背根神经节细胞通过N1无血清选择培养基的选择培养，存活的大部分是神经元，其他卫星细胞，胶质细胞以及成纤维细胞不易存活，经过体外24h培养，培养的DRG神经元可以认为相对稳定，并且能够基本反映DRG细胞的病理生理特性，我们选择KA损伤的细胞模型研究GDNF对DRG神经元在病理情况下的作用，以便进一步阐明GDNF潜在的生理作用，同时也为研究GDNF在不同条件下的不同作用提供理论依据.
图3－ 图4 略
GDNF最初被纯化并克隆出主要依其对中脑DA能神经元的促营养作用，Lin等［5］ 的研究表明:GDNF能特异性促进胚胎中脑酪氨酸羟化酶（TH）免疫阳性神经元的存活;加速TH神经元的分化过程和突出的长出，增加神经元表达TH基因，提高TH细胞摄取DA的能力，是目前已知DA能神经元营养因子作用最敏感的一种细胞因子，但对培养的GA-BA能与5-HT能神经元无明显生物活性，背根节神经元在正常培养条件下，对GDNF反应也不敏感，GDNF是否在DRG神经元整个发育过程中没有特异性作用.一直是科研工作者争论的热点.本研究表明GDNF具有一种在正常条件下有潜在的保护作用，细胞一旦受损，这种潜在作用就会显现出来.
KA是含有二羧基的吡咯烷，是与谷氨酸相关的一类兴奋性神经毒素，它的神经兴奋性作用比谷氨酸强许多倍.用海人藻酸对培养的DRG神经元造成损伤后，细胞自身的调节能力有限，不可能承受外界对其的侵袭性损伤，于是细胞损伤加重甚至死亡［6］ .当GDNF进入培养体系后GDNF与C-Ret结合［7］ ，可能使细胞信息系统发生了相应调整，使得调节细胞KA的维持系统有所增强，首先表现为高亲和力的Na+ 依赖性KA载体对细胞内外的KA进行有效的调节，使得过量KA降解而维持生理状态下KA能神经传递.其次KA的作用仅局限于α异构体［8，9］ ，如果异丙烯侧主链还原或KA空间结构位置反向，均会使效力明显丧失，C-ReT介导的蛋白磷酸化反应使得KA异构酶被激活，于是许多KA构形发生变化而丧失效力.同时KA的低亲和力受体、君子酸受体等可被高浓度的Mg2+ 等阻断，GDNF的生物学作用可能使Mg2+ ，Ca2+ 依赖性蛋白酶（磷酸酶，氧化酶等）被激活，使得胞质内结合的Mg2+ 释放，Mg2+ 转运利用加速，阻断了KA受体，从而消除了KA能传入通路兴奋氨基酸的来源，于是减弱细胞的进一步损害（也与胞质Ca2+ 超载被缓解有关）.从我们的实验结果来看，加GDNF与不加GDNF组的细胞活性，存活的细胞数，总蛋白的合成都有显著的差异，对突起生长没有明显的保护作用.由此不难推断GDNF对KA兴奋性毒素损伤的DRG神经元具有保护作用，它可以减轻KA对神经元的损伤，延缓DRG神经元受损伤的发展，纠正损害引起的病理改变，保护受损的神经元，刺激损伤神经元潜在的代谢机制，减轻功能缺陷的程度，介导一些应急信息，从而进一步达到衰减KA的目的，但是这一保护作用是有限的，对突起的保护作用不明显.这可能是因为GDNF的调节能力有限，这对于GDNF在早期临床潜在的神经损伤疾病中的应用提供了依据.
参考文献
［1］Munson JB，Mcmahon SB.Effect of GDNF on axotomized sen-sory and motorneurons in adult rats ［J］.Eur J Neurosci，1997;9（6）:1126-1129.
［2］Batchelor PE，Liberatore GT，Wong JY，Porritt MJ，FrerichsF，Donnan GA，Howells DW.Activated macrophases and mi-croglia induce dopaminergic spouting in the injured striatum and express brain-derived neurotrophic factor and glial cell line-de-rived neurotrophic factor ［J］.J Neurosci，1999;19（5）:1708-1716.
［3］Houenou LJ，Oppenheim RW，Li L，Lo AC，Prevette D.Regu-lation of spinal cord motoneuron survival by GDNF during devel-opment and following injury ［J］.Cell Tissue Res，1996;286（2）:219-223.
［4］Mosmenn T.Rapid colormetric assay for cellular growth and survival to proliferation and cytotoxic assay ［J］.J Immunol Methods，1983;12（4）:28-32.
［5］Lin-LF，Doherty DH，Lile JD.GDNF:A glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons ［J］.Sci-ence，1993;260（5111）:1130-1132.
［6］Moldrich RX，Cheung NS，Pascoe CJ，Beart PM.Excitotoxic injury profile of low-affinity kainate receptor agonists in cortical neuronal cultures ［J］.Eur J Phommaol，1999;378（2）:R1-3.
［7］Treanor JJ，Goodman L，de Sauvage F，Stone DM，Poulsen KT，Beck CD，Gray C，Armanini MP，Pollock RA，Hefti F，Phillips HS，Goddard A，Moore MW，Buj-Bello A，Davies AM，Asai N，Takahashi M，Vandlen R，Henderson CE，Rosenthal A.Characterization of a multicomponent receptor for GDNF ［J］.Nature，1996;382（6586）:80-83.
［8］Burazin TC，Gundlach AL.Up-regulation of GDNFR-alpha and c-ret mRNA facial motor neurons following facial nerve injury in the rat ［J］.Brain Res，1998;55（2）:331-336.
［9］Coyle JT.Neurotoxic action of kainic acid ［J］.J Neurochem，1983;41（1）:1-11.