作者：贾林涛，于翠娟，许彦鸣，朱 峰，彭玮丹，苏成芝，王成济，杨安钢
【关键词】 天冬氨酸蛋白酶类
关键词: 天冬氨酸蛋白酶类;脱噬作用;肿瘤;基因疗法
摘 要:目的 观察重构型caspase-3及其N-端融合蛋白的表达对HeLa细胞的凋亡诱导作用. 方法 用反转录PCR获取人caspase-3基因，用重组PCR方法构建人重构型caspase-3及其融合蛋白基因，将基因克隆入表达载体pcDNA3，脂质体法转染HeLa细胞，通过细胞计数、电镜观察、MTT法等检测被转染细胞的生长及其凋亡状况. 结果 成功获得了cas-pase-3基因，构建了重构型caspase-3基因和重构型caspase-3与绿脓杆菌外毒素（PE）转膜结构域部分肽段的融合蛋白基因及其表达载体，与对照组相比，在转染后1～4d内，两种基因的表达均导致HeLa细胞存活数减少，大量细胞发生凋亡，且二者活性相当. 结论 重构型caspase-3及其融合蛋白可以诱导转染的HeLa细胞发生凋亡.
Keywords:aspartic proteinases;apoptosis;neoplasms;gene therapy
Abstract:AIM To investigate the induction of HeLa cells to apoptosis by the expression of reversed caspase-3and its N-terminal fusion protein.METHODS RT-PCR and recombi-nant PCR were used to amplify human caspase-3gene and construct reversed caspase-3and its fusion protein genes.Following cloning into expression vector pcDNA3and trans-fecting HeLa cells，we evaluated the growth condition and apoptosis of these cells by cell counting，electron microscope photographs，as well as MTT assays.RESULTS We suc-cessfully obtained human caspase-3gene，the genes and ex-pression vectors of reversed caspase-3and its fusion protein with part of the translocation domain of Pseudomonas exo-toxin A（PE）.Compared with the control group，the expres-sion of both genes caused in a similar degree the decrease of living cell numbers and massive occurrence of apoptosis.CONCLUSION Both reversed caspase-3and its fusion pro-tein can effectively induce HeLa cells to apoptosis.
0 引言
Caspase，即天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate-specific protease），是一类在细胞凋亡中起关键作用的蛋白酶家族［1-3］ ，而Cas-pase-3更是在凋亡的信息传递中居于核心地位［4-6］ .它在细胞中通常以酶原形式存在，包含一个N端原结构域（prodomain），大亚基和小亚基，在外界或自身凋亡因素的刺激下，酶原被切割，其中原结构域被去除，大、小亚基游离并组装成具有活性的caspase-3分子.活化后的caspase-3识别底物蛋白特异的四肽序列（其中第4位氨基酸为天冬氨酸，如IETD），并在天冬氨酸羧基侧切割蛋白质，从而导致多种细胞结构及功能蛋白失活，或促凋亡蛋白活化，使细胞走向凋亡［6，7］ .Srinivasula等从活性caspase-3晶体结构中得到启示，将caspase-3大、小亚基基因颠倒，使小亚基位于大亚基前端，构建了一种新型的caspase-3分子（重构型caspase-3），它可以自发折叠成具有活性的三维结构形式，而不需上游分子的切割活化［8，9］ .绿脓杆菌外毒素（pseudomonas exotoxin A，PE）是一种毒性极强的细菌外毒素分子，它包含由613个氨基酸构成的3个功能结构域，其中253至364位氨基酸（domain II）被认为与分子的转膜作用相关［10］ .本文研究了重构型caspase-3分子在细胞中的表达及活性，并进一步考察了它与PE domainⅡ部分肽段构建的融合蛋白的促凋亡活性.
1 材料和方法
1.1 材料
①细胞系:人淋巴瘤Jurkat及人宫颈癌HeLa细胞系分别由本室路凡硕士和刘慧萍博士馈赠;②菌种和质粒:E.coli DH5α菌种、pUC19，pcD-NA3载体均为本室保存;③工具酶及试剂:限制性内切酶、莫罗尼鼠类白血病毒（M-MLV）反转录酶、T4DNA连接酶等购自Promega公司，Taq酶、新生牛血清、RPMI1640，DMEM及脂质体lipofec-tamineTM2000为Gibco公司产品.
1.2 方法
1.2.1 Caspase-3基因的获取及克隆
培养Jurkat细胞至对数期，收集细胞，细胞数应在5～10×106 ，用TRIZOL试剂提取细胞总RNA，设计引物P1，P2（P1:5’-TTTGAATTCATGGAGAACACTGAA-AACTCA-3’;P2:5’-TTTGGATCCTTAGTGA-TAAAAATAGAGTTC-3’），以P2为引物，反转录出cDNA第一链，用P1，P2为引物，PCR得到cas-pase-3基因，以EcoRI和BamHI双酶切后克隆入pUC19相应位点，转化E.coli，并进行测序.
1.2.2 Caspase-3基因改建及真核表达载体的构建
设计引物，分别扩增caspase-3大、小亚基基因，用重组PCR方法进行连接，使小亚基编码序列位于上游，得到重构型caspase-3编码序列（rc3），进一步用重组PCR方法在5′端连接绿脓杆菌外毒素（PE）253-364氨基酸的编码序列，得到重构型Caspase-3融合蛋白基因（pr3），上述序列以EcoRI/XbaI酶切，克隆入真核表达载体pcDNA3，测序.
1.2.3 细胞转染、转染后细胞计数及电镜观察
转染前24h将HeLa细胞重铺在12个6cm培养皿中，使每皿细胞数在1×106 ～2×106 ，待细胞长至皿底面积80%时进行转染.12皿细胞分为3组，分别转染pcDNA3，pcDNA3-rc3和pcDNA3-pr3.将6μg DNA，15μl lipofectAMINETM 2000，1mL无血清DMEM混合成转染液，静置20min，用于转染一皿细胞.细胞用无血清DMEM洗2次，加入4mL无血清DMEM，逐滴加入转染液，边加边轻轻混合.37℃孵育8h，弃去转染液，换含100mL・L-1 血清的DMEM培养液继续培养，分别于转染后24，48，72和96h消化细胞，用血球计数板计数，离心收集剩余细胞，4℃预冷的200mL・L-1 戊二醛固定，送第四军医大学电镜室制片，进行电镜观察.
1.2.4 MTT法检测目的基因表达对细胞生长增殖的影响
将HeLa细胞培养在96孔板中，脂质体法转染pcDNA3，pcDNA3-rc3和pcDNA3-pr3，每孔转染0.3μg DNA，分别于转染后24，48，72和96h进行MTT检测.检测时每孔加入1.5mg・mL-1 MTT20μL，继续孵育4h，用酶联免疫检测仪测定各孔490nm吸光度（A）值，每次检测12孔，计算平均值.
2 结果
2.1 RT┐PCR获得人Caspase┐3基因
提取人Ju-rkat细胞总RNA，以P1，P2为引物，RT-PCR扩增出约840bp的片段（Fig1），克隆入pUC19后测序，经与Genbank中人caspase-3比较，序列与之完全一致.
2.2 Caspase┐3基因的改造及表达载体的构建
以pUC19-caspase-3为模板，经过一系列重组PCR，得到了大小分别为0.85kb和1.2kb的重构型cas-pase-3（rc3）和caspase-3融合蛋白（pr3）的基因（Fig2），并经测序证实，上述基因克隆进入真核表达载体pcDNA3，EcoRI/XbaI双酶切鉴定结果如Fig3所示.
2.3 rc3和pr3基因的转染抑制HeLa细胞生长
以pcDNA3空载体作对照，分别用克隆有重构型caspase-3和caspase-3融合蛋白基因的pcDNA3转染人HeLa细胞，发现两实验组细胞在转染后均有大量死亡（Fig4），定时进行细胞计数，结果显示，转染目的基因的两实验组细胞存活数均明显少于同时期转染空载体的对照组（Tab1）.表1 重构型caspase-3或其融合蛋白表达载体转染细胞后细胞计数结果（略）
用pcDNA3，pcDNA3-rc3和pcDNA3-pr3转染培养在96孔板中的HeLa细胞，于转染后不同时间 进行MTT检测，并绘制曲线（Fig5）.结果表明，与对照组相比，实验组细胞在转染后24h A490nm 即明显偏低，显示其生长增殖受到影响，转染后48h和72h，这种影响进一步扩大，至96h时，实验组与对照组A490nm 差值趋小.两实验组相比，它们对细胞生长增殖的影响大致相当，72h后，caspase-3融合蛋白的这种影响略强.
2.4 rc3和pr3基因转染诱导HeLa细胞凋亡
以pcDNA3为对照，分别用pcDNA3-rc3和pcDNA3-pr3转染HeLa细胞，转染后2～3d进行电子显微镜观察，发现实验两组细胞有的出现细胞体积缩小，膜表面出泡（Fig6A），有的核膜发生皱折，或染色质凝缩，聚集于核膜下（Fig6B），有的核形成碎片，或形成凋亡小体，有的甚至正被周围细胞吞噬（Fig6C）.相比之下，对照组细胞并未出现这些变化（Fig6D）.
Caspase-3是细胞凋亡中的重要效应蛋白酶，它在许多细胞凋亡途径中居于核心地位.它通常只有在被上游分子切割后才活化，引起细胞凋亡.Srini-vasula等［9］ 将caspase-3大、小亚基基因颠倒，构建成的新型caspase-3分子可以不经切割而自发折叠成具有活性的效应分子，这种分子的活性在人乳腺癌MCF-7细胞中得到了初步验证.我们通过反转录PCR（RT-PCR）的方法从人Jurkat细胞中获得了caspase-3基因，并用重组PCR的方法进行改造，构建了与上述新型caspase-3相似的基因，称为重构型caspase-3，在此基础上进一步构建了氨基端融合有一段具有膜转位作用的PE domainⅡ部分肽段的基因，观察由此构建的融合蛋白是否仍具有诱导凋亡作用.将这种重构型caspase-3及其融合蛋白基因克隆进入真核表达载体pcDNA3，转染人宫颈癌HeLa细胞系，瞬时表达目的基因，并通过细胞计数、电子显微镜观察、MTT法等对转染细胞进行了研究.
细胞计数是检测细胞存活数目的最直接的方法，而四唑盐（MTT）比色实验则是检测细胞存活和生长的重要手段，在一定细胞数范围内，结晶物形成的量与细胞数成正比.本实验中分别用两种方法对目的基因转染后的HeLa细胞进行测定，得到了基本一致的结论，即实验组细胞在转染后24h，细胞数及A490nm 值均较对照组偏低，转染后48～72h，这种差距进一步明显，表明目的基因的表达抑制了细胞的生长增殖，两实验组相比，caspase-3融合蛋白的这种抑制作用更明显一些.在转染后96h，两实验组与对照组A490nm 差值有缩小的趋势，分析是由于在本实验采用的瞬时转染条件下，未被转染的细胞增殖的结果.
进一步用电子显微镜对转染细胞的形态进行观察，发现实验组细胞出现膜出泡、染色质凝缩、凋亡小体形成等典型的凋亡特征，据此推断，目的基因的表达可以有效地诱导细胞发生凋亡.
以上研究表明，我们构建的两种caspase-3基因的表达均可以通过诱发细胞凋亡的途径抑制HeLa细胞生长增殖，甚至导致大量细胞死亡，验证了重构型caspase-3在肿瘤细胞中的自发活性.对于cas-pase-3融合蛋白，N端PE肽段的存在并没有降低其促凋亡活性，这可能是由于该肽段的存在并未影响到蛋白质活性结构域的折叠.本研究将为重构型cas-pase-3的实际应用提供理论依据.
参考文献
［1］Cohen GM.Caspases:The executioners of apoptosis ［J］.Biochem J，1997;326:1-16.
［2］Bai QY，Huang GS，Wang Z，Zhang XH.bcl-xL gene confers
multidrug resistance in leuke-mia cells ［J］.Di-si Junyi Daxue
Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（1）:45-47.
［3］Alnemi ES，Livingston DJ，Nicholson DW，Salvesen G，Thoen-berry NA，Wong WW，Yuan J.Human ICE/CED-3protease nomenclature ［J］.Cell，1996:87:171.
［4］Zhang HL，Wang WL，Hu LZ.Detection of the mutation of p53and K-ras genes and their expression products ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（9）:769-771.
［5］Fernandes-Alnemri T，Litwack G，Alnemri ES.CPP32，a novel human apoptotic protein with homology to caenorhabditis ele-gans cell death protein Ced-3and mammalian interleukin-1be-ta-converting enzyme ［J］.J Biol Chem，1994;269（49）:30761-30764.
［6］Nicholson DW，Ali A，Thornberry NA，Vaillancourt JP，Ding CK，Gallant M，Gareau Y，Griffin PR，Labelle M，Lazebnik YA.Identification and inhibition of the ICE/CED-3protease nessary for mammalian apoptosis ［J］.Nature，1995;376:37-43.
［7］Schwart SM.Cell death and the caspase cascade ［J］.Circula-tion，1998;97:227-229.
［8］Liu F，Zhang X，Cao WD，Zhang JN，Wang ZX，Yi SY，Zhang HZ.Effects of exogenous p16/CDKN2gene on the cell cycle and proliferation of SHG-44glioma cell line ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（4）:294-296.
［9］Srinivasula SM，Ahmad M，MacFarlane M，Luo Z，Huang Z，Fernandes-Alnemri T，Alnemri ES.Generation of constitutive-ly active recombinant caspase-3and-6rearrangement of their subunits ［J］.J Biol Chem，1998;273:10107-10111.
［10］Gray GL，Smith DH，Baldridge JS，Harkins RN，Vasil ML，Chen EY，Heyneker HL.Cloning，nucleotide sequence，and expression in Escherichia coli of the exotoxin A structural gene of Pseudomonas aeruginosa ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1984;81:2645-2649.转贴于