关于rhBMP┐2在体内诱导成骨中I，II型胶原及碱性磷酸酶的表达

作者：杜俊杰 罗卓荆 胡蕴玉 李志创 吕荣


【关键词】 骨形态发生蛋白
　　关键词: 骨形态发生蛋白;I型胶原;II型胶原;碱性磷酸酶;骨生成
　　
　　摘 要:目的 对rhBMP-2在诱导成骨中Collagen I，II及碱性磷酸酶（ALP）的表达进行研究. 方法 将含rhBMP-20.5mg的松质骨载体植入55只BALB/c小鼠的右侧股部肌袋内，分别于术后3～21d共8个时间点取材，采用免疫组织化学方法对新生骨组织中的I，II型胶原进行检测;对ALP活性进行定量分析，观察rhBMP-2在诱导成骨中Collagen I，II及ALP的表达情况. 结果 ①II型胶原的出现是和成软骨、软骨细胞的出现相伴随的，但是，肥大、变性的软骨细胞并不表达II型胶原;②作为成骨细胞成熟标志物的I型胶原、ALP在软骨形成期即有表达，但是随着成骨细胞的出现，骨组织的形成I型胶原仍表现为高表达，而ALP的表达则呈下降趋势. 结论 在诱导成骨中rhBMP-2促进了Collagen I，II及ALP的表达.

　　Keywords:bone morphogenetic protein;collagen I;collagen II;alkaline phosphatase;osteogenesis
　　
　　Abstract:AIM To study expression of collagen I，II and al-kaline phosphatase in osteogenesis by rhBMP-2.METHODSCompositions of rhBMP-2（0.5mg）and cancellous bone car-rier were implanted in the right thigh pouch of55BALB/c mice.In order to investigate expression of collagen I，II and alkaline phosphatase in osteogenesis by rhBMP-2，immuno-histochemistry analysis was performed3，5，7，9，11，14，17and21days after the implantation.Meanwhile，alkaline phosphatase activity was measured7，14，21days after the implantation.RESULTS 1.The appearance of type II colla-gen was accompanied by that of chondroblasts and chondro-cytes，but hypertrophic and degenerative chondrocytes did not express type II collagen.2.Type I collagen and ALP，osteoblast differentiation markers，were expressed at the ear-ly stage of chondrogenesis，but type I collagen was still ex-pressed at higher level，ALP decreased gradually with the ap-pearance of osteoblasts and osteogenesis.CONCLUSION rhBMP-2might stimulate expression of collagen I，II and al-kaline phosphatase in osteogenesis.
　　
　　0 引言
　　
　　BMP为骨基质中重要骨生长因子，它能诱导未分化的间充质细胞不可逆地分化形成软骨和骨，从而导致新骨的形成［1］ .实验证明rhBMP-2有明显的诱导成骨活性［2，3］ .软骨细胞、成骨细胞和骨细胞是骨组织发育过程中的三种主要细胞，II型胶原是软骨细胞合成的软骨基质中的特异性胶原蛋白，而I型胶原则为骨组织中的成骨细胞合成的特异性胶原蛋白.I，II型胶原蛋白的含量反映了软骨细胞和成骨细胞的成熟状况.碱性磷酸酶（ALP）也是成熟的成骨细胞的标志之一，其活性的高低也可反映成骨细胞的成熟状况.我们采用免疫组织化学的方法对反映成骨细胞和软骨细胞形成及成熟状况的I，II型胶原进行检测;对骨组织中的ALP活性进行定量分析，以分析rhBMP-2对诱导成骨的调节作用及其机制.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 牛松质骨载体的制备及复合
　　我们选择异种松质骨作为载体［2］ .取新鲜小牛四肢骨骨端，去除骨膜、骨髓、皮质骨及软骨组织后，将其松质骨部分制成4mm×4mm×4mm的骨粒，以温水冲洗，去除血污及表层油脂.1V∶1V氯仿/甲醇脱脂12h，以300mL・L-1 过氧化氢脱蛋白24h，以0.6mol・L-1 盐酸完全脱钙24h（取样品测钙含量为16.31μg・g-1 干质量），修剪成每粒（11±0.1）mg，低温冻干.将rhBMP-2（由军事医学科学院基础所惠赠）加0.1mol・L-1 PBS溶液（pH7.4）后，用物理的方法匀浆成混悬液，按实验设计将rhBMP-2混悬液与牛松质骨载体充分混匀，真空抽吸，冻干.
　　
　　1.2 方法
　　雄性BALB/c小鼠55只，6～8wk龄，体质量20～22g.将复合植骨材料植入小鼠右侧股部肌袋内，复合植骨材料含rhBMP-20.5mg，分别于术后3，5，9，11和17d各处死5只作组织切片，用以测定Collagen I，II的表达情况.于术后7，14和21d各处死10只，其中5只作组织切片，5只用于测定单位组织重量的碱性磷酸酶活性.
　　
　　1.2.1 Collagen I，II检测
　　标本以40g・L-1 多聚甲醛固定，然后置复合脱钙液24h，水洗，脱水，石蜡包埋，制成4μm连续性切片，collagen I免疫组织化学染色采用SABC法;collagen II免疫组织化学染色采用S-P法.
　　
　　1.2.2 ALP活性测定
　　对7，14和21d时间点动物取材后，清除标本表面的肌肉，称质量，置入5mL塑料管中再加入2mL生理盐水，机械匀浆，离心，取上清测标本单位组织质量的ALP活性.
　　
　　统计学处理:实验数据采用SPLM软件（本校预防医学系卫生统计学教研室）进行方差分析处理.
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 Collagen I免疫组织化学染色
　　术后3，5和7d，I型胶原蛋白的表达为阴性.术后9d，I型胶原蛋白表达呈弱阳性，其阳性表达部位位于少数软骨细胞的胞质和胞外基质.术后11～21d，I型胶原蛋白的表达均呈阳性，其阳性表达部位位于成骨细胞的胞质及其细胞间质以及编织骨的骨基质（Fig1）.但随着骨组织的成熟，成骨细胞转变为骨细胞，表达I型胶原蛋白的细胞数量有所减少.
　　
　　2.2 Collagen II免疫组织化学染色
　　术后3d，II型胶原蛋白的表达呈阴性.术后5d，II型胶原蛋白的表达呈弱阳性，其阳性表达部位位于软骨细胞的胞质及其胞外基质.术后7～11d，II型胶原蛋白的表达为阳性，其阳性表达部位除位于软骨细胞的胞质及其细胞基质外，骨小梁也阳性表达（Fig2）.但肥大、变性的软骨细胞并不表达II型胶原（Fig3）.术后14，17d，随着骨组织的逐渐成熟，表达II型胶原蛋白的软骨细胞及胞外基质明显减少.术后21d，随着骨组织的成熟，II型胶原蛋白的表达为阴性. 转贴于 　2.3 ALP活性测定
　　术后7，14和21d碱性磷酸酶活性测定结果分别是（416.75±50.01），（1166.90±
　　 83.35）和（666.80±666.80）nkat・g -1 ，三个时间点ALP活性测定结果存在明显差异（P&<0.01）.
　　3 讨论
　　
　　BMP作为重要的骨生长因子，除对参与骨诱导，骨形成的各种细胞进行调节外，还调节细胞外基质的合成与降解.BMP对I，II型胶原蛋白及碱性磷酸酶的调节较为复杂.众所周知，BMP能诱导未分化的间充质细胞不可逆地分化形成软骨和骨，并且促进软骨基质的合成.它也能作用于成骨细胞增加成骨表型的胶原蛋白的合成［4］ .这一作用可能是部分通过对转录的调控而实现的.从实验结果可以看出:术后5d，II型胶原蛋白呈弱表达.术后9d，I型胶原蛋白的表达呈弱阳性.而碱性磷酸酶在术后7d即有较高的表达，术后14d达到高峰，而后逐渐下降.实验结果提示，骨生长因子对胶原合成的影响可能是骨生长因子直接作用于软骨和成骨细胞通过对转录的调控而实现的，也可能是骨生长因子通过影响其他的骨生长因子而间接地调控软骨细胞和成骨细胞对胶原蛋白的表达［4］ .
　　
　　在软骨分化期，II型胶原的表达是和成软骨及正在增殖的软骨细胞的出现相伴随的，但肥大、变性的软骨细胞II型胶原的表达呈阴性.说明很可能有对II型胶原快速表达及对其低调的调控.也可能有些因子如细胞素，核蛋白，在软骨分化过程中抑制了II型胶原的表达.这也说明II型胶原是在软骨形成的早期阶段表达的.而I型胶原在软骨和骨分化的过程中均有表达，其在软骨分化期表达的细胞可能是骨软骨的祖细胞分化而来，后期可能分化为成骨细胞［5］ .尽管ALP被认为是成熟的成骨细胞的标志之一，其活性的高低可反映成骨细胞的成熟状况.但在实验中我们发现ALP活性在术后7d即有较高的表达，而此时正是成软骨和软骨细胞出现的时间，这一结果和Sakano等［5］ 及Bernard等［6］ 的实验结果相一致.这些结果提示［5］ ，骨形成开始于软骨溶解之前.而且成软骨细胞的增殖和ALP mRNA的表达结果也提示，在软骨形成的早期即已开始了组织矿化的转录前调节.14d之后，虽然组织矿化仍在进行，但ALP水平在下降.这提示，14d之后，在新生骨组织 中ALP仍然存在，而且发挥着钙结合蛋白的作用 ［7］ .说明了软骨形成期ALP mRNA的高表达是BMP诱导成骨中组织矿化的先决条件［5］ .
　　
　　适宜的载体可保护rhBMP-2不发生非特异性蛋白水解，并对它们的释放起到缓释作用.经化学处理后的牛松质骨可作为BMP的良好载体 ［2，8］ .骨生长因子在骨诱导、骨形成中的调节作用是必不可少的，在适宜的剂量条件下，骨生长因子促进了新骨的形成，否则可能出现抑制骨形成的作用.
　　参考文献:
　　
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　　［2］Du JJ，Hu YY，Luo ZJ.Synergism of rhBMP-2and TGF-βin osteoinduction and osteogenesis ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（7）:555-558.
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　　［4］Takuwa Y，Chizuko O，Elizabeth A.Bone morphogenetic pro-tein-2stimulates alkaline phosphatase activity and collagen syn-thesis in cultured osteoblastic cells，MC3T3-E1［J］.Biochem Biophys Res Commun，1991;174（1）:96-101.
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　　［6］Bernard B，Bianco P，Bonucci E.Biochemical and immunohis-tochemical evidence that in cartilage an alkaline phosphatase is a Ca2+ -binding glycoprotein ［J］.J Cell Biol，1986;103:1615-1618.
　　［7］McLean FM，Keller PJ，Genge BR.Disposition of preformed mineral in matrix vesicles:Internal localization and association with alkaline phosphatase ［J］.J Biol Chem，1987;262:10481-10487.
　　［8］Du JJ，Luo ZJ，Hu YY.A suitable carrier for bFGF in osteoin-duction by rhBMP-2enhanced by bFGF ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（12）:1489-1491.转贴于