作者：孙明林，胡蕴玉，贾新斌，李丹，刘忠湘，朱德生
【关键词】 骨形态发生蛋白
关键词: 骨形态发生蛋白;磷酸钙类;骨水泥;生物相容性材料
摘 要:目的 将自行合成的磷酸钙骨水泥（CPC）作为载体与BMP复合成人工骨，检测其生物相容性. 方法 制备CPC/BMP及CPC骨块，通过体外实验、细胞培养、动物实验等方法观察其毒性、免疫原性、对血液系统的影响等生物相容性指标. 结果 动物实验表明材料属无毒级，不含致热原，体外试验不引起溶血反应，对凝血功能无明显影响.植入兔或小鼠肌袋内未检测出特异性抗体.组织学检查未见免疫排斥反应，对肌肉无刺激作用.对体外培养的细胞增殖没有明显抑制作用. 结论 材料有较好的生物相容性，临床使用安全.
Keywords:bone morphogenetic protein;calcium phosphate;bone cement;biocompatibility materials
Abstract:AIM To construct CPC/BMP composite by com-bining CPC with BMP，and to detect their biocompatibity.METHODS The toxicity，pyrogen，hemolytic activities and immunogen were detected by means of animal test，cell cul-ture，hemolysis test and histochemical technique.RESULTS The composites were found no toxicity and no pyrogen by an-imal test，no hemolytic activities and couldn’t influence the coagulate of blood in vitro.When the materials were grafted into the muscle pounches in the thigh of mice or rabbits，no obvious specific antibodies produced were detected in serum by ELISA，nor were significant immune reaction of foreign body observed by histochemistry technique.The composites were also testified no cytotoxicity in vitor for the proliferation of cultured cells couldn’be inhibited.CONCLUSION The CPC/BMP composite might have good biocompatibility and be safe for clinical use.
0 引言
骨形态发生蛋白（BMP）是存在于人和动物骨骼、牙齿等组织中的一种蛋白质，能够异位诱导间充质细胞分化为软骨和骨细胞而形成新骨［1-3］ .单独将BMP植入体内易被血液冲刷掉而不能最大限度地发挥诱导成骨活性.同时，由于缺少载体的支架作用BMP也不易放置.目前已有多种材料用作BMP的载体，如松质骨、磷酸钙陶瓷、聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PLGA）、胶原、纤维蛋白凝块等 ［4］ .因其各自的理化性质不同，降解及参与体内代谢方式各不相同，在临床实际应用中各有优缺点.我们自行合成了一种新型的非陶瓷型羟基磷灰石类人工骨材料―自固化磷酸钙骨水泥（CPC），将其作为载体与BMP复合成人工骨，现就其生物相容性的有关研究作一报道.
1 材料和方法
1.1 材料
牛BMP由本校西京医院全军骨科研究所综合骨库提供.参照Urist等［5］ 方法并加以改进，从新鲜牛皮质骨中提取.经小鼠肌袋实验证明有较高的骨诱导活性.CPC制备
参考文献
方法合成［6，7］ ，由固相粉末和液相两部分组成，固相主要成分为磷酸四钙（TTCP），磷酸氢钙（DCPD），磷酸二氢钙（MC-PA），磷酸三钙（TAP）和无水磷酸二氢钙（MCPA）.固化液为磷酸溶液.干燥BMP称重后剪成碎块，浸泡于CPC固化液中24h，玻璃匀浆器研磨成悬浊液.CPC固相粉末与含BMP的固化液按比例调和成糊状，固化结晶后备用.CPC骨块用固化液按上述方法制得.以上两种骨块环氧乙烷灭菌.
1.2 方法
1.2.1 急性毒性试验
选用本校实验动物中心提供的健康成年大鼠10只，体质量（200±20）g，雌雄不限.随机分为两组，每组5只.将灭菌备用的CPC/BMP和CPC骨块研磨成粉末，生理盐水配成1kg・L-1 的混悬液，无菌条件下向大鼠腹腔内注入1mL，观察72h，记录动物有无死亡及不良反应.
1.2.2 亚急性毒性试验
健康成年大鼠15只，体质量（200±20）g，雌雄不限，随机分成3组.实验前称体质量、检查血常规、肝肾功能和血清蛋白含量.将灭菌备用的CPC/BMP和CPC骨块研磨成粉末，生理盐水配成200g・L-1 的混悬液灌胃.剂量为1g・kg-1 质量，隔日1次，共10次.对照组给等量生理盐水灌胃.实验期间观察记录体质量变化及动物活动情况.21d取血检查血常规、肝肾功能和血清蛋白含量.处死后取肝、脾、肾称重，40g・L-1 甲醛固定，切片染色，光镜检查.
1.2.3 溶血试验
①心脏穿刺抽取兔血10mL，立即加入20g・L-1 的草酸钾0.5mL，混和抗凝.取抗凝兔血8mL，加入生理盐水10mL，稀释备用;②测试组样本制备:灭菌备用的CPC/BMP和CPC骨块研磨成粉末，分别称取0.1，0.3和0.5g，加入盛有生理盐水10mL的1，2，3号试管中，37℃保温30min，再加入稀释兔血0.2mL，轻摇.37℃保温60min，10000g离心5min，取上清测定545nm处的吸光度;③对照组:阴性对照3管，为生理盐水10mL加入稀释兔血0.2mL;阳性对照3管为蒸馏水10mL加入稀释兔血0.2mL，其余步骤同上;④计算方法:溶血率= 试验材料的吸光度-阴性对照的吸光度阳性对照的吸光度-阴性对照的吸光度×100%.
1.2.4 凝血试验
西京医院血库健康献血员新鲜血浆，用自动血液凝固测定仪进行凝血酶原凝固试验（PT）、测定部分凝血活酶凝固时间（APTT）、凝血酶凝固时间（TT）和纤维蛋白原.取血浆2mL加入CPC/BMP或CPC粉100mg，混合后再测定上述指标，观察材料对凝血功能的影响.
1.2.5 热原试验
健康成年中国家兔3只，体质量3.0～3.2kg，846复合麻醉剂0.4mL・kg-1 质量麻醉后，测量肛温两次，间隔1h，取平均值为正常体温.灭菌后的CPC/BMP复合物研磨成粉末，取2.0 g与20mL生理盐水制成混悬液，耳iv，5mL/只.注射后1，2和3h测量体温变化，3次中最高一次减去正常值为体温升高数.
1.2.6 肌肉刺激试验
将CPC/BMP和CPC复合物制成直径约0.7cm的圆形颗粒，环氧乙烷灭菌后植入家兔股部肌肉内.术后2，4和8wk取材，40g・L-1 甲醛固定后，切片，HE染色镜检.
1.2.7 体外细胞毒试验
选用对外界毒性物质非常敏感的成骨肉瘤细胞，用MTT法测定材料对细胞增殖的影响.①取96孔细胞培养板，每孔加入0.1mL含有（2～5）×104 个成骨肉瘤细胞的培养液，37℃50mL・L-1 CO2 条件下陪养2～3h，使细胞贴壁;②将灭菌备用的CPC/BMP和CPC骨块研磨成粉末，生理盐水配成100g・L-1 的混悬液并做2，4，8和16倍稀释.每个培养孔中分别加入混悬液及倍比稀释液0.1mL，每组重复3孔.阳性对照加入抗肿瘤药物，阴性对照加入0.1mL RPMI1640培养液.37℃50mL・L-1 CO2 培养72h.吸取培养液，PBS缓冲液洗涤1次;③每孔中分别加入0.1mL PBS缓冲液和10μL MTT染液（5g・L-1 ）.37℃50mL・L-1 CO2 培养6h;④每孔中加入0.1mL酸化异丙醇，振荡混匀5min，使紫色结晶溶解.DG3022型酶联免疫检测仪上测定吸光度.波长570nm.
1.2.8 血清特异性抗体检测
将CPC/BMP和CPC复合物制成直径约0.5cm的圆形颗粒，环氧乙烷灭菌后植入小鼠股部肌袋内，术后1，2，3和4wk眼球取血，凝固后离心，分离小鼠抗体血清，用ELISA方法检测血清中特异性抗体.①抗原包被:将CPC/BMP和CPC复合物研成粉末，4℃生理盐水浸渍24h，离心取上清液，用Na2 CO3 /NaHCO3 包被缓冲液稀释，加入微量滴定板中，0.1mL/孔.37℃放置1h，4℃过夜.洗涤液洗涤3次;②待测抗体血清用1mL・L-1 BSA1∶20稀释，加入微量滴定板中，0.1mL/孔.正常小鼠血清为阴性对照，空白对照不加任何血清.37℃孵育1h，洗涤液洗涤3次;③加入1∶200HRP酶标抗体，0.1mL/孔.37℃孵育1h，洗涤液洗涤3次.加入1∶4000TMB底物显色，0.1mL/孔.37℃孵育20min，每孔加入2mol・L-1 h3 SO4 0.05mL终止反应;④DG3022型酶联免疫检测仪上测定A值.以A值大于等于阴性对照的2.1倍为阳性，说明有特异性抗体产生，否则为阴性.
2 结果
2.1 急性毒性试验
所有动物均无死亡，活动、进食情况基本正常，精神状态无明显变化.未见瘫痪、惊厥、呼吸抑制等不良反应.结论:CPC/BMP复合物和CPC按毒性分级属于无毒级.
2.2 亚急性毒性试验
所有动物均无死亡，一般情况良好，活动正常.实验组进食量较对照组及实验前略有下降.实验前后体质量、血常规、肝肾功能和血清蛋白含量无显著差异（P&>0.05）.实验组与对照组肝、脾、肾重量无显著差异（P&>0.05）.病理切片检查未见细胞变性、坏死.结论:CPC/BMP复合物和CPC无慢性毒性. 2.3 溶血试验
试验组各管均无溶血现象，离心后上层为清亮无色液体，下层为CPC颗粒及红细胞沉淀物.涂片镜检未见红细胞破裂、凝集.按非直接接触血液的医用生物材料生物性能测试所提出的溶血率&<5%标准，CPC/BMP和CPC的溶血率均符合要求.体外试验不引起溶血（Tab1）.表1 溶血试验测定结果（略）
2.4 凝血试验
材料混合前后，血浆中PT，APTT，TT和纤维蛋白原四项指标检测结果无明显变化，说明材料不引起凝血功能的改变.
2.5 热原试验
各实验组体温升高均在0.6℃以下，3只家兔温度升高总数在1.4℃以下，符合热原检测规定，说明材料无致热作用.
2.6 肌肉刺激试验
CPC/BMP组术后2wk材料周围有软骨细胞生成，并伴有少量吞噬细胞和慢性炎细胞，4wk有较多的软骨细胞和岛状的骨细胞，8wk骨细胞向材料内部长入，材料边界不清，有降解现象.CPC组术后2wk植入物周围有慢性炎细胞浸润，4wk材料周围出现纤维组织包裹，8wk包裹的纤维组织增厚.以上两组均未见到肌肉组织的变性坏死.说明材料对正常肌肉组织无刺激作用.
2.7 体外细胞毒试验
每组3孔测定结果取平均值，经统计学处理，实验组与阳性对照组差别显著（P&<0.05），说明材料对细胞增殖无明显影响，无细胞毒性.
2.8 血清特异性抗体检测
阴性对照平均A值为0.136，各实验组A值均不大于阴性对照的2.1倍，说明血清中无特异性抗体产生.
3 讨论
材料的毒性和生物相容性（biocompatibility）是评价新材料时必须考虑的一个问题.生物相容性是指植入体内的生物材料在正常发挥某一特定作用的同时，对宿主只引起适当反应的能力
［8］ .生物材料在植入体内的反应可分为以下几种类型［9］ :①周围组织发生变性坏死，说明材料有毒;②被周围组织吸收而消失，证明材料无毒且可被溶解或降解;③材料周围形成不同厚度的纤维组织包膜，提示为生物惰性材料;④如果是无毒的生物活性材料，将会与组织形成互相间的有机结合.目前，对生物材料的相容性评价方法主要有两类，一是动物体内实验，既将材料植入体内做组织学性检查，观察材料及周围组织病理变化;另一类为体外试验，即用材料或浸提液研究材料对组织细胞生长、代谢及增殖方面的影响.Johson ［10］ 认为，在区别生物材料的毒性及对细胞影响方面，体外试验较体内植入更敏感.
具有良好生物相容性的骨移植材料要求无毒、无热原.对周围组织无刺激作用，植入后不引起溶血反应，能逐步被降解吸收和被机体组织替代［8］ .同时不引起免疫排斥反应，无致癌性和致畸作用.本研究通过一系列实验证明自行合成的CPC无毒，无刺激性，不含有致热原，具有良好的血液相容性和组织相容性，与国外同类产品相近 ［6-7，11-12］ .BMP是一类种属非特异性的蛋白质，不同种属间BMP具有高度的同源性［13］ ，理论上不引起免疫排斥反应.本实验中CPC/BMP组小鼠血清抗体检测A值较单纯CPC组以及阴性对照略有升高，可能与使用的BMP为粗提物有关.这种轻微的免疫反应是一过性的，不产生特异性的抗体，对机体没有不良影响.通过肌肉植入实验，我们发现CPC/BMP复合人工骨有较强的骨诱导活性，在新骨形成的同时，材料逐渐开始降解（相关实验研究另文发表）.良好的生物相容性和较强的骨诱导活性使CPC/BMP可望成为一种较理想的骨移植代用材料.
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