【关键词】 玻璃体视网膜病
关键词: 玻璃体视网膜病，增生性;肌动蛋白类;免疫组织化学
摘 要:目的 观察PVR增生膜中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达. 方法 用免疫组化染色法和免疫荧光法对14例视网膜脱离伴PVR行玻切术时切除的增生膜（PRM）进行检查、分析. 结果 免疫组化染色法显示α-SMA在14例PRM中均有表达，位于胞质中，其分布与PRM的收缩方向一致.在200倍视野下，PRM C级膜中α-SMA阳性细胞比例为35/80，D级膜中α-SMA阳性细胞比例为50/60;免疫荧光法结果与染色法相符.荧光定量分析:PRM C级膜中α-SMA阳性荧光总量12.31.D级膜中α-SMA阳性荧光总量23.09，约为C级膜的1.88倍（P&<0.01）. 结论 α-SMA存在于PVR增生膜中，与病变程度和膜的收缩过程有关.
Keywords:vitreoretinopathy proliferative;actins;immuno-histochemistry
Abstract:AIM To investigate the expression of alpha-smooth muscle actin（α-SMA）within the periretinal mem-brane（PRM）of PVR.METHODS Fourteen specimens of PRM were obtained during vitrectomies of patients suffered from PVR of different grades.α-SMA expression in PRM were detected by immunohistochemical staining，and quanti-tative analysis performed by image process of immunofluo┐rescence.RESULTS α-SMA expression was detected in all14PRMs.The distributions ofα-SMA were present in the cytoplasma，and accordance with the direction of stress fibers..α-SMA expression was stronger in PVR/D than in PVR/C.CONCLUSION Expression ofα-SMA was a com-mon feature of PRM，and the expression correlated with severity of PVR and the process of membrane traction.
0 引言
增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreo-retinopathy，PVR）属于眼内组织创伤愈合的一种特殊表现，可以分为炎症期、细胞增生期和瘢痕期三个阶段，其中在细胞增生期可以形成视网膜表面的增生膜组织（PRM），这些膜组织在瘢痕期可以明显收缩，形成对视网膜的牵拉而导致视网膜脱离［1，2］ .视网膜色素上皮细胞（RPE）是参与增生膜形成的主要细胞之一，在PVR病变过程中可以有明显的形态改变，部分RPE可以转化为肌纤维母细胞样细胞而具有收缩功能［3］ .α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）是一种有收缩功能的细胞骨架微丝结构
［4］ .McGillem［5］ 等曾报道:在PVR病变的增生膜中有多种细胞表达α-SMA，但针对α-SMA在增生膜中的整体表达及其与PVR病变程度的相关性研究，尚未见报道.本实验采用免疫组化技术，观察PVR的视网膜前膜中α-SMA的表达情况.
1 材料和方法
1.1 材料
标本来源于1998-07/1999-11在本院眼科住院的孔源性视网膜脱离伴PVR患者14名，年龄4～63岁，病程2mo～2a.PVR分级标准参照1983年美国视网膜学会分级方法，分级为C3-D3.以上患眼行玻璃体切割术时取视网膜表面增生膜，其中下膜5例，前膜9例.以上组织用40g・L-1 多聚甲醛固定30min，4℃.经脱水、透明和浸蜡，制成腊块，然后制成5μm厚的切片，贴附于载玻片上.小鼠抗人的α-SMA单克隆抗体（1∶200;中国博士德公司），DAB免疫组化试剂盒（DAKO公司，丹麦），Avidin标记的Texas Red（Molecular Probes，美国）. 1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学染色及免疫荧光
切片浸入7.5mL・L-1 h3 O2 -PBS，37℃，30min，以阻断内源性过氧化物酶.正常羊血清封闭消除非特异性染色.滴加小鼠特异性抗体，在湿盒内37℃保温30min.PBS振洗3次，滴加生物素化羊抗小鼠IgG，在湿盒内37℃保温30min，免疫组织化学染色法滴加ABC复合剂，37℃保温30min.加入显色剂显色，镜下观察，水洗中止反应，苏木精复染核，脱水透明封片.免疫荧光法加入抗生物素化标记的Texas Red，37℃保温30min.缓冲甘油封片.采用人大隐静脉血管组织作为阳性对照;采用人类角膜移植后供体眼的眼后段组织，包括视网膜色素上皮细胞（RPE）、视网膜组织、脉络膜和巩膜，以及不加一抗的标本作为阴性对照，与手术取材标本平行染色.
1.2.2 结果判定和分析
免疫组织化学DAB染色法的结果:在OLMPUS显微镜（BX50）下观察，以背景清晰、棕黄色部位定位明确的细胞作为阳性细胞，在200倍视野下，计数阳性细胞比例.
Texas Red荧光标本在BIO-RED共聚焦显微镜（MR-1024）下观察，作定量分析:任意选一视野，在相同面积下计数荧光总量.
2 结果
阳性对照组显示均对所用的单克隆抗体呈阳性反应:DAB染色阳性细胞胞质中呈现棕色或深棕色的颗粒，细胞核经复染成蓝色;Texas Red在595nm激光激发下，阳性部位发出深红色颗粒样荧光.阴性对照组中未见阳性染色及荧光.
DAB染色结果显示，在14例PRM中α-SMA均有阳性表达，但其表达的程度有所差别.在6例PVR/C3级的PRM中，可见细胞成份较多，细胞间质较少，α-SMA表达阳性细胞的比例为35/80，呈散在分布，随分布区域的不同细胞染色以及形状表现有差异:在膜的表面可见少量染色较深，胞体呈梭形，胞核呈圆形或卵圆形的阳性细胞;在细胞较多的区域，阳性细胞数目较多，染色较浅淡，胞体为长圆形，胞核呈圆形，在部分阳性细胞中可见色素存在（Fig1（略））;在膜的中央组织中可见少量阳性细胞，胞体呈狭长的梭形，与标本的长径走行方向平行;在8例D级PRM中，α-SMA阳性细胞比例约为50/60，多分布在膜的表面，染色深，细胞呈梭形，胞核为长圆形（Fig2（略）），常可见此类细胞在膜组织的起伏处呈“搭桥样”存在，在组织的中央区域阳性细胞较少.
免疫荧光与DAB染色结果相一致.在C级膜中，阳性部位多位于膜的周边，量较少（Fig3（略））;在D级膜中，阳性部位多位于膜的表面，量较多（Fig4（略））.
3 讨论
在本实验中，我们观察到在14例不同时期PVR病变组织中α-SMA均有表达，α-SMA阳性细胞在C级和D级的PRM中有不同的表达程度，在C级膜中呈散在分布，大部分阳性细胞染色较浅淡;在D级PRM中主要分布在膜的表面，阳性细胞的走行多与膜标本横断面的长径一致或呈“搭桥样”存在，阳性染色为明显的深棕色.这一结果提示在PVR病变中存在α-SMA的表达以及阳性细胞数量存在着动态变化的过程，这个过程对PRM的重新塑形以及收缩能力的改变可能有重要作用.
α-SMA是一组表达在多种类型细胞胞质中的具有收缩功能的微管微丝结构，是细胞移行和具有收缩 功能的基础.同时可以作为一种特异性免疫组化染色标志来标识肌纤维母细胞［6］ .肌纤维母细胞多存在于一些需要收缩功能的组织中，如肺泡的间隔、血管等［7］ .在病理条件下，肌纤维母细胞是参与伤口收缩的主要成份，其收缩功能对减小创面的面积以及后期的瘢痕重新塑形有重要的作用［8］ .
RPE是参与PVR形成的重要细胞成份［9］ ，RPE脱离原位后可以发生明显的形态和功能的变化［10，11］ .Lewis等［12］ 报道，在PRM中存在一种有足突的RPE细胞，电镜观察下这种细胞内有大量呈集束状排列的微丝，同时细胞核有明显的切迹，提示其可能有收缩现象，在这些细胞与细胞之间以及细胞与细胞外基质之间存在多种形式的联结，这些联结被证实对组织的收缩功能是有相当重要的作用.而这些特点与肌成纤维母细胞［13］ 是十分相似的. 转贴于 RPE的异常转型过程可能对PVR的发生过程有重要的意义［14］ .脱离原位后的RPE上皮表型以及胞质内的色素颗粒逐渐消失，合成多种细胞外基质，并表达α-SMA ［5］ ，导致眼内过度的损伤愈合过程以及收缩能力的持续增加.特别是α-SMA的持续表达对PVR的发生有重要意义［15］ .
从我们实验的结果来看，在C级的PRM中，有较多的细胞成份存在，同时也有较多α-SMA阳性细胞，但着色浅淡，提示在这些细胞中α-SMA的表达较弱;在D级PRM中虽然细胞数目明显减少，而α-SMA阳性细胞的着色明显加深，定量分析显示α-SMA在D级膜中的表达量是C级膜的1.88倍.从分布上看，其附着点位于PRM收缩的“受力点”位置.从RPE转型的特点来看，RPE在C级PRM中轻度表达α-SMA的过程可能与细胞本身合成细胞外基质、移行以及具有一定的收缩能力有关;而在D级PRM中，RPE明显表达α-SMA可能与其增强的收缩能力有关，这种α-SMA阳性细胞在数量上的变化和空间重新分布的表现，可能是RPE细胞在PRM中处于不同位置受到不同应力作用的结果.同时也提示PVR病变中，大部分RPE细胞可以在转型的过程失去其收缩功能，而处在某些特殊空间位置的RPE其收缩的功能反而明显增强，这种变化与牵拉性视网膜脱离的形成会有相当重要的作用.
参考文献
［1］Weller M，Wiedemann P，Heimann K.Proliferative vitreo-retinopathy is it anything more than wound healing at the wrong place ［J］.Int Ophthalmol，1990;14（2）:105-117.
［2］Hui YN，Sorgente N，Ryan SJ.Posterior vitreous separation and retinal detachment induced by macrophages ［J］.Graefe’s Arch Clin Exp Ophthalmol，1987;107（3）:1147-1151.
［3］Vinores SA，Campochiaro PA，Mcgehee R.Ultrastructural and immunocytochemical changes in retinal pigment epithelium，retinal glial，and fibroblasts in vitreous culture ［J］，InvestOph-thalmol Vis Sci，1990;31（12）:2529-2545.
［4］Stodtler M，Mietz H，Wiedemann P.Immunohistochemistry of anterior proliferative vitreoretinopathy ［J］.Int Ophthalmol，1994-95;18（6）:323-328.
［5］McGillem GS，Dacheux RF.Rabbit retinal muller cells undergo antigenic changes in response to experimentally induced prolif-erative vitreoretinopathy ［J］.Exp EyeRes，1999;68（5）:617-627.
［6］Grisanti S，Guidry C.Transdifferentiation of retinal pigment epi-thelial cells from epithelial to mesenchymal phentype ［J］.In-vest Ophthalmol Vis Sci，1995;36（2）:391-405.
［7］Schurch W，Seemayer TA，Gabbiani G.Myofibroblast in stern-berg ss ed Histology for pathologists ［M］.New York:Raven Press，1992;109-114.
［8］Nedelee M，Ghahary A，Scott PG.Control of wound contrac-tion.Basic and clinical features ［J］.Hand Clin，2000;16（12）:289-302.
［9］Toti P，Greco G，Catella AM.Morphological and pathogenetic aspects of proliferative vitreo-retinopathy.A histological and immunohistochemical study ［J］.DocOphthalmol，1994;88（2）:105-112.
［10］Vinores SA，Campochiaro PA，Mcgehee R.Simultaneous ex-pression of keratin and glial fibrillary acidic protein by the same cells in epithelial membranes ［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1992;33（12）:3361-3366.
［11］ Campochiaro PA.Pathogenic mechanisms in proliferative viteroretinopathy ［J］.Arch Ophthalmol，1997;115（2）:237-241.
［12］Lewis GP，Matsumoto B，Fiaher SK.Changes in the organiza-tion and expression of cytoskeletal proteins during retinal de-generation induced by retinal detachment ［J］.Invest Ophthal-mol Vis Sci，1995;36（12）:2404-2416.
［13］Gabbiani，Majno G.Dupuytren’s contracture:Fibroblast con-traction?an ultrastructural study ［J］.Am J Pathol，1972;66（1）:131-146.
［14］ Campochiaro PA.Pathogenic mechanisms in proliferative viteroretinopathy ［J］.Arch Ophthalmol，1997;115（1）:237-241.
［15］Fuchs U，Kivela T，Tarkkanen A.Cytoskeleton in normal and reactive human retinal pigment epithelial cells ［J］.Invest Oph-thalmol Vis Sci，1991;32（13）:3178-3186.转贴于