关键词: 超声检查，多普勒，彩色;鼠科;脑;原癌基因蛋白质c-Fos类
摘 要:目的 探讨诊断剂量彩色多普勒超声（彩超）对胎鼠中枢神经系统是否有刺激. 方法 用诊断剂量彩超（探头频率3.5MHz，Pwr=0dB，MI=1.7，TIB=0.9）照射孕18d大鼠子宫体表投影区，分为照射10，20，30min和对照组共4组.应用免疫组化方法检测胎鼠脑中Fos蛋白的表达，采用方差分析比较各组间差异. 结果 照射10min组于胎鼠脑海马及皮层出现散在分布的淡染Fos弱阳性细胞，阳性细胞百分率为（2.61±1.8）%;而照射20min及30min组于海马、皮层及基底节均有密集分布的深染Fos强阳性细胞，阳性细胞百分率分别为（64.39±14.05）%和（71.45±11.73）%，该两组分别与10min组有显著性差异（P&<0.01）.对照组未观察到着色的Fos阳性细胞. 结论 诊断剂量的彩超辐照孕鼠20min以上可诱导胎鼠脑组织Fos蛋白高表达.
Keywords:ultrasonography，Doppler，color;muridae;brain;proto-oncogene proteins c-Fos
Abstract:AIM To study whether the central nervous sys-tem of fetal rat could be stimulated by diagnostic color Doppler ultrasound.METHODS Pregnant rats were ex-posed to diagnostic color Doppler ultrasound（3.5MHz，Pwr=0dB，MI=1.7，TIB=0.9）with four groups:10min，20min，30min and control group.Immunohischemistry was
used to detect the expression of protein Fos and the analysisof variance was used to compare the difference between groups.RESULTS Poor-stained Fos-positive neurons were seen scattered in the fetal brain hippocampus and cerebral cortex in the10min group，with the rate of Fos-positive was（2.61±1.80）%，while a crowd of robust-stained Fos-positive neu-rons were seen in hippocampus，with the rate of which were（64.39±14.05）%and（71.45±11.73）%，cerebral cortex and basal ganglia in20min and30min groups.There were significant differences（P&<0.01）between10min and the other two exposed groups respectively.No Fos-positive neu-rons was seen in the control group.CONCLUSION The high expression of protein Fos in fetal rat brain could be in-duced by diagnostic color Doppler ultrasound when exposed for more than20minutes.
0 引言
超声在临床上越来越广泛地应用于诊断各方面，超声仪器的更新和发展也向超声场的能量表征参量提出了挑战.传统的表征参量包括Isata（空间平均和时间平均声强），Isppa（空间峰值与脉冲平均声强），Im（空间峰值与最大半周期内的平均声强），-P（峰值负压）等，目前有关超声生物效应的研究也仍沿用上述参量［1-3］ .但从1993年美国FDA及许多机构团体建议使用新的标准，即MI（机械指数）和TI（热指数）来提示发射的超声能量所产生的潜在生物效应.本实验采用具有此标准的超声仪器辐照孕鼠，观察其对胎鼠脑组织Fos蛋白的影响.
1 材料和方法
1.1 材料
健康性成熟SD大鼠20只（本校实验动物中心提供），其中雄性4只，体质量370～420g，雌性16只，体质量300～350g.将雌雄鼠按照2 1比例合笼后，次日起每日查阴栓及阴道涂片，镜检到活精子之日记为受孕0日，依此推算孕龄.孕鼠在受孕18d接受超声照射，按照照射时间随机分为4组，0（对照组），10，20及30min，每组4只.美国Acuson公司Se-quoia512型彩色超声诊断仪，探头彩色频率3.5MHz，彩色增益50dB，Pwr=0dB，MI=1.7，TIB=0.9，聚焦深度20mm，彩色取样框深度50mm，角度覆盖全部扫查范.全部声学参数由Acuson公司提供.c-fos免疫组化试剂盒及DAB显色剂由博士德公司提供. 1.2 方法 受孕18d的母鼠仰卧固定于木板上，于下腹部外涂耦合剂，沿孕鼠子宫部位的体表投影区缓慢滑行移动.照射时间分别为10，20及30min;对照组进行假照射，条件一律相同.孕鼠辐照后2h用10g L-1 戊巴比妥钠4mL kg-1 ip麻醉后，剖腹剖宫取胎，每只孕鼠随机取2只胎鼠，迅速断头取出脑组织于40g L-1 中性甲醛固定24h.固定后的脑组织常规石蜡包埋连续冠状切片，切片贴于涂有多聚赖氨酸的涂胶片上烘干.组织切片常规脱蜡、梯度酒精至水后，蒸馏水新鲜配制的30mL L-1 h3 O2 孵育10min，水洗，抗原修复液20min，水洗，羊血清封闭20min.c-fos抗体4℃孵育24h，羊抗兔IgG37℃孵育2h，ABC复合物37℃孵育2h.以上各步之间需用0.01mol L-1 PBS洗涤.DAB显色剂A，B，C各一滴加蒸馏水至1mL，滴加于切片上显色，镜下控制显色程度.常规脱水、透明、封片，光镜下观察，着棕黄色者为阳性细胞.阴性对照组以0.01mol L-1 LPBS取代c-fos一抗.
统计学处理:每份标本统计3张阳性细胞最多的切片，每张切片统计1个Fos阳性细胞集中的区域，记数每高倍镜视野阳性细胞百分率，取平均值，采用多个样本均数比较的方差分析.
2 结果
超声辐照10min组于胎鼠脑海马、皮层出现散 在分布的淡染Fos弱阳性细胞，而辐照20及30min组可于脑海马、皮层及基底节见到密集分布的深染Fos蛋白强阳性细胞数量明显增多，其细胞记数均与10min组有明显差异（P&<0.01）），并且随辐照时间延长阳性细胞数有所增加（Tab1）.对照组胎鼠脑组织切片中未见到着色的Fos阳性细胞.免疫组化阴性对照组也无着色的Fos阳性细胞.表1 胎鼠脑组织Fos阳性细胞百分率结果（略）
3 讨论
十几年来，临床应用的超声仪器输出能量在逐渐增高，其热机制及非热机制所致的潜在生物效应也在逐步提高，因而美国FDA要求新型产科超声仪器必须显示MI及TI［4］ .MI=Pr.3/f，即以0.3dB/cm MHz减小的峰值压强.多种资料表明非热机制，如空化效应产生的生物效应随峰值压强的增加而增加，随探头频率的增加而降低，因此MI能将二者结合起来综合评价其致生物效应的潜在性［5，6］ .TI=W0 /WDEG ，W0 为声源的时间平均功率，WDEG 为被照射的目标温度上升1℃所需要的超声功率，因此TI可用来估计操作过程中被检测部位的温升，而Ispta则不能指示或估计超声引起的温度增加.TI包括三种指标:TIC（骨表面热指数）TIS（软组织热指数）TIB（骨聚焦处热指数），每一种适用于监测不同的检查目的，其中TIB尤其适用于多普勒检查中、晚期妊娠时监测骨及聚焦处附近的温升.每一台超声仪器的MI和TI都有可能大于1.但有学者［7］ 指出为了降低超声生物效应，对于实时B超，MI应&<1.
产生超声生物效应的机制目前推测为热机制及非热机制，后者包括空化机制和机械机制.目前诊断超声使用的是脉冲波，它引起的瞬态温升在骨表面尤为明显8］ .Dalecki［9］ 诊断频率的脉冲波照射孕18d的大鼠（脉冲重复频率100Hz，持续时间10ms，照射3min），结果胎鼠脑出血的比例增高.虽然扫查式的超声照射（二维及彩超）引起的温升多位于表浅部位，而非扫查式（M型及多普勒）照射多接近于聚焦区，但在许多情况下，如果声束轴上有骨组织，则最大温升发生于骨附近，因而包裹于颅骨内的胎儿脑组织是首先考虑的加热区.正是由于脑组织本身的娇嫩敏感性［10］ 及所处位置的易损性，使得我们将研究重点放在脑组织的超声生物效应上.
Fos蛋白是c-fos基因的表达产物，它能启动活化不同的靶基因，产生长时程的分化、增殖的各种蛋白，进而影响细胞功能及代谢.自1987年起创立的c-fos技术已使Fos蛋白成为中枢神经系统功能活动的标志物［11-14］ .我们采用免疫组化方法标记胎鼠脑组织中的Fos蛋白，以此观察彩超对神经系统的影响. TI和MI受许多因素影响，如输出功率、探头频率、聚焦位置、彩色取样框的深度、大小和位置等.彩超较普通二维超声能量大，故其MI，TI均有所增高，我们应用的MI为1.7，TI为0.9.实验结果表明孕鼠接受彩超照射20min可诱导Fos蛋白的高表达，照射30min组阳性细胞数多于20min组，而照射10min组Fos的阳性细胞数与对照组无显著差异.说明在本实验条件下彩超照射20min可刺激胎鼠的神经元.已有研究［15］ 认为c-fos基因的表达可能与神经细胞的异常电活动有关，本实验中彩超诱导的Fos表达是否与之有关尚不可知.目前已知的产生超声生物效应的两种机制之间会互相影响，瞬态空化会产生局部高温，而温升又会影响到空化的强度.多数研究探讨了在这相互作用中氧自由基等的化学变化及作用，而这其中是否触发了神经细胞的膜电位从而引起了异常电活动还须进一步研究.
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