关于人脊索瘤细胞的体外侵袭性

作者：常恒　马保安　张殿忠　文艳华

【关键词】 脊索瘤
　　关键词: 脊索瘤;肿瘤侵袭;尿激酶型纤溶酶原激活物;免疫组织化学
　　
　　摘 要:目的 观察人脊索瘤细胞在体外侵袭性的大小，探讨与肿瘤侵袭性密切相关的尿激酶型纤溶酶原激活物（uroki-nase-type plasminogen activator，uPA）在侵袭中的作用. 方法 利用体外球体侵袭模型观察人脊索瘤细胞的侵袭特性和侵袭过程;应用免疫组化SABC法检测脊索瘤细胞中uPA的表达情况，并且观察用uPA抗体后肿瘤细胞侵袭性的变化. 结果 肿瘤细胞球体在接触预培养的鸡胚心肌块（preculture heart fragment，PHF）后3d即包绕PHF，并有部分侵袭，接触培养5d，每个PHF即有一半左右被侵袭，10d左右，PHF即完全被侵袭.免疫组化染色，阳性细胞占63%，为uPA高表达.在培养液中加入uPA抗体后，肿瘤细胞侵袭性减低. 结论 人脊索瘤细胞具有一定的侵袭性;该细胞uPA高表达;uPA抗体可使脊索瘤细胞的侵袭性减低.
　　
　　Keywords:chordoma;invasion;urokinase-type plasminogen activator;immunohistochemistry
　　
　　Abstract:AIM To evaluate the invasion of human chordo-ma cell in vitro，and the effects of urokinase-type plasmino-gen activator on tumour invasion.METHODS The invasive capacity and the invasive process of chordoma cells were ob-served with invasion model of tumour cell spheroid aggregate in vitro;Applying streptavidin-biotin complex（SABC）immunohistochemical technique，the expression of uPA in human chordoma cell line was studied.RESULTS 3d after PHFs confronted cultured with tumour cell spheroid aggre-gates，they were sphered and invaded.5d after confronting cultured，about the half of PHF was invaded and10days af-ter，most of PHFs were completely invaded.uPA was ex-pressed in human chordoma cell，the positive rate was63%.The invasion of chordoma cell was decreased when the mono-clonal antibodies of uPA were added in fluid medium.CONCLUSION Human chordoma cell line has a high capaci-ty of invasion in vitro，and has high uPA expression.The an-tibody of uPA may decrease the invasion of chordoma cell line.
　　
　　0 引言
　　
　　脊索瘤起源于胚胎残留的脊索组织，多发生于人体中轴骨，骶尾部较常见，组织学表现为低度恶性，发生转移较晚［1］ ，但其局部表现为侵袭性生长，边界不清，手术复发率较高［2］ .有关脊索瘤的侵袭性研究目前尚未见报道，我们利用本所建立的人脊索瘤细胞系（CM-319），采用体外球体侵袭模型观察了人脊索瘤细胞的侵袭特性和侵袭过程，用免疫组化SABC法检测脊索瘤细胞中uPA的表达情况，并观察了加入uPA mAb对脊索瘤细胞侵袭性的影响.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 脊索瘤细胞系为本所建立，常规传代培养.鸡胚用受精鸡蛋于孵箱中孵育.免疫组化兔抗人uPA mAb为Oncogen Science Inc.产品，一抗及SABC试剂盒（即用型）均购自武汉博士德生物工程公司.
　　
　　1.2 方法
　　
　　1.2.1 球体侵袭试验 参照高进［3］ 方法加以改进.①瘤细胞球体的制备:将长满瓶壁的脊索瘤细胞划割成1cm×1cm的方块，用不含EDTA的胰蛋白酶消化后，移入底部铺有琼脂的培养瓶中培养3d;②球体器官块的制备:取孵育9d的鸡蛋，无菌条件下取出鸡胚心脏，剪去大血管和心房，将心室肌剪成0.4mm×0.4mm×0.4mm的小块，置于底部铺有琼脂的培养瓶中常规培养3d;③侵袭复合体的制备:将制备好的瘤细胞球体与鸡胚心肌块（PHF）移入底部铺有琼脂的24孔板内，每孔一对，使其紧密接触，4h后加入培养液，继续培养.在培养后1，3，5，7，10和14d分别取材制作组织切片.培养过程中用倒置显微镜观察侵袭过程.
　　
　　1.2.2 免疫组化SABC染色 于培养皿内放置数张盖玻片，将脊索瘤细胞悬液滴于其上培养，待细胞长满后进行染色.染色方法按说明书上步骤进行，以PBS代替一抗作为阴性对照.结果判定:阳性以瘤细胞胞质、胞膜出现棕黄色染色为准.随机在显微镜高倍视野下计数1000个瘤细胞，无阳性细胞或阳性细胞&<5%为阴性;阳性细胞5%～50%为弱阳性;阳性细胞≥50%为强阳性.
　　
　　1.2.3 uPA抗体抑制侵袭试验 将1∶100的uPA mAb加入球体侵袭试验侵袭复合体的培养液中，每孔加入50μL，并设对照，培养、取材方法与上述相同.
　　
　　图1 － 图5 略
　　 　　
　　2 结果
　　
　　2.1 侵袭试验结果 侵袭试验共重复两次，结果相似.球体与PHF接触培养后1d，球体内瘤细胞可见核分裂相（Fig1）;培养后3d，球体的细胞已沿PHF表面移动，对其形成包绕，并已有部分侵袭（Fig2）;接触培养后5d，瘤细胞已侵袭每个PHF的一半左右（Fig3）;培养10d后，PHF几乎完全被瘤细胞所取代（Fig4）.加入uPA抗体后，接触培养3d，瘤细胞虽对PHF形成包绕，但未见侵袭;接触培养5d，始有小部分侵袭;接触培养10d，侵袭面积尚不足一半，瘤细胞的侵袭速度明显减慢. 　2.2 免疫组化结果 人脊索瘤细胞uPA表达阳性率为63%，为高表达.阳性细胞表现为胞质、胞膜呈棕黄色染色，阳性细胞分布较均匀（Fig5）.
　　
　　3 讨论
　　
　　肿瘤侵袭即肿瘤细胞从原发瘤或继发瘤向邻近宿主组织侵犯和占领.一般认为，侵袭过程包括三个基本方面:侵袭瘤细胞占领邻近正常组织;同时使邻近的宿主组织发生变性（或坏死）;瘤细胞占领和宿主组织变性在时间上和空间上都是进行性的［4］ .研究肿瘤的侵袭性需要一个良好的模型，我们选用的体外球体侵袭模型，将攻击细胞制成球体，无论在形态结构上还是在生物学特性上均与实体瘤相似，并且具有合成和分泌细胞外基质酶的能力［5］ ，保持了原瘤细胞的侵袭特性，使得在器官培养中能正确地评价侵袭力.用PHF作为靶器官具有较易适应外界环境、对缺氧不敏感、存活时间长、来源丰富、经预培养使其具有类似体内器官包膜等优点.因此，这一模型具有较明显的优势.
　　我们利用体外球体侵袭模型观察到了人脊索瘤细胞侵袭PHF的过程，大致分为4个阶段:①球体的瘤细胞向PHF粘着;②紧密固定于PHF的表面;③瘤细胞包绕PHF并穿过PHF外周类似纤维细胞层;④侵入PHF深层，形成瘤细胞巢，进而取代全部PHF组织.同时观察到瘤细胞如遇到肌束或其他间隙则先沿间隙侵袭，继而再侵袭心肌细胞. uPA能使纤溶酶原激活成纤溶酶，后者能降解细胞外基质和基底膜成分，如纤维蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白等，从而有利于肿瘤的浸润和转移［5］ .许多研究已证实uPA系统可调控细胞的侵袭:Holst等［6］ 研究发现用抗uPA抗体抑制uPA的活性，可使侵袭发生延迟;Ossowski等［7］ 报道利用人类肿瘤在裸鼠中播散模型发现，用抗人uPA抗体可抑制肿瘤细胞的局部侵袭.本实验用免疫组化SABC法检测到了人脊索瘤细胞uPA高表达，并且用抗uPA抗体使脊索瘤细胞对PHF的侵袭力减弱，与以上作者的结果一致，证明uPA在脊索瘤细胞的侵袭中发挥着重要的作用.
　　参考文献:
　　
　　［1］Mindell ER.Current concept review.Chordoma ［J］.Bone Joint Surg，1981;63A（3）:501-505.
　　［2］Meis JM，Raymond AK，Evans HL.Dedifferentiated chordo-ma:A clinicopathology and immunohistochemical study of three case ［J］.Am J Surg Pathol，1987;11（7）:516-525.
　　［3］Gao J.A model in vitro for tumor invasion ［J］.Chin J Oncol，1987;9（1）:69-72.
　　［4］Mueler-Klieser W.Multicellular spheroids:A review on cellular aggregates in cancer research ［J］.Cancer Res Clin Oncol，1987;113:101-107.
　　［5］Dano K，Andreasen PA，Grondahl-Hanse K.Plasminogen acti-vators tissuse degradation and cancer ［J］.Adv Cancer Res，1985，44:139-146.
　　［6］Hols-Hansen C，Johannessen B，Hoyer-Hansen G.Urokinase-type plasminogen activation in three human breast cancer cell lines collelates with their in vitro invasiveness ［J］.Clin Exp Metastasia，1996;14:297-307.
　　［7］Ossowski L，Payne HR，Wilson EL.Inhibition of urokinase-type plasminogen activator by abtibodies:The effect on dissemi-nation of a human tumor in the nude mice ［J］.Cancer Res，1991;51:274-281.转贴于