关于人前列腺癌中P21CIP1/WAF1 ，Rb的表达意义

　　　　 作者：杨力军，邵国兴 ，刘荣福，王禾 ，陈宝琦

【关键词】 前列腺肿瘤
　　关键词: 前列腺肿瘤;P21CIP1/WAF1 ;基因，视网膜母细胞瘤;免疫组织化学
　　
　　摘 要:目的 研究P21 CIP1/WAF1 及Rb在人前列腺癌标本中的表达以及两者的相关性，以阐述它们与前列腺癌的病理分级及临床分期的关系. 方法 应用免疫组化SABC法染色技术对36例前列腺癌标本进行检测，观察P21 CIP1/WAF1 及Rb在前列腺癌各病理分级，临床分期中的表达及相关性. 结果 在36例人前列腺癌标本中，P21CIP1/WAF1 和Rb免疫组化阳性染色为棕黄色或棕褐色，分别定位于细胞质和细胞核，其中P21CIP1/WAF1 阳性19例，阳性率52.8%.Rb阳性17例，阳性率47.2%.在不同病理分级、临床分期之间差异均有显著性，但实验结果未发现P21 CIP1/WAF1 与Rb有显著相关性. 结论 P21CIP1/WAF1 ，Rb的表达与前列腺癌组织的病理学分级、临床分期呈负相关性，在前列腺癌分子发病机制中可能涉及到P21CIP1/WAF1 ，Rb调节通道的异常.　　
　　Keywords:prostatic neoplasms;P21CIP1/WAF1 ;genes，retinoblastoma;immunohistochemistry
　　
　　bstract:AIM To research the expression and correlation of P21 CIP1/WAF1 and Rb in human prostate cancer，for the pur-pose of illustrating their relations to the pathological grading and clinical phases.METHODS We tested the36samples of prostate cancer by applying the immunohistochemical SABC method and observed the expression and correlation of P21 CIP1/WAF1 and Rb in human prostate cancer，and applied this method to the study of the clinical phases.RESULTS In the above mentioned36samples，the immunohistochemistry pos-itive of P21 CIP1/WAF1 and Rb showed the color of brown or dark brown，which were in cytoplasm and nucleus.Among them，19cases is P21　　 CIP1/WAF1 positive，rated52.8%，and17is Rb positive，rated47.2%.Statistically the significant differ-ences of P21CIP1/WAF1and Rb were found in different pathological grading and clinical phases but no significant cor-relation was found between p21 CIP1/WAF1 and Rb respectively.CONCLUSION Experiment shows a negative correlation be-tween the expression of P21 CIP1/WAF1 and Rb and the pathologi-cal grading and clinical phases.The pathogenic mechanism of the prostate cancer is related to the abnormal path for P21CIP1/WAF1 and Rb.　　
　　0 引言
　　
　　前列腺癌在欧美国家发病率较高，东亚地区发病率较低，但有增高趋势，我国近年来该病的发病率较20世纪60年代前明显增高 ［1］ .对前列腺癌的诊治已日益受到重视.P21 CIP1/WAF1 （P21）是细胞周期中重要的调控因子，协调DNA的复制及修复，在细胞的生长、分化和衰老中起重要的作用［2-4］ .Rb是人类发现的第一个抑癌基因，在细胞周期进程中有调控作用［5］ .有关它们在前列腺癌中的研究文章较少，我们采用免疫组化SABC法对前列腺癌标本P21 CIP1/WAF1 ，Rb进行检测，探讨它们的表达及其相互关系.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料
　　36例1982～1999年确诊前列腺癌石蜡包埋存档标本，年龄48～84岁，平均67岁，手术摘除29例，活检7例，均为前列腺腺癌，其中25例来自兰州军区总院，11例来自第四军医大学西京医院.前列腺癌的病理分级采用Bǒcking（1982）的三级标准［6］ ，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ级分别有13，9和14例.临床分期采用1993年版吴阶平主编泌尿外科标准分为A，B，C，D四期.分别各有13，9，8和6例.全部标本均经40g・L-1 缓冲中性甲醛液固定，石蜡包埋，5μm连续切片两张，烤片后备染，其中一张行HE染色复诊，一张行免疫组化研究.鼠抗P21单克隆抗体（187）及兔抗Rb多克隆抗体（C-15）均购自于美国Santa Cruz Biotechnology，Inc，工作浓度1:100;SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士得生物工程公司. 1.2 方法 采用免疫组织化学SABC法，各步骤按说明书进行，组织抗原修复采用Sanyo EM-715FW微波炉“慢速烹调、高火力档”15min，DAB显色，逐级脱水、透明、封片.用已知肝细胞肝癌阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作空白对照.实验数据均采用χ2 检验处理.
　　
　　2 结果
　　
　　在日产Olympus BH-2型显微镜下行双盲法阅片，按染色强度分为0级:染色阴性;1级:用×100倍放大可清晰辨认染色;2级:用×40倍放大可清晰辨认染色.又按染色数量分为0级:细胞无染色;1级:染色细胞数少于1/3;2级:染色细胞数少于2/3;3级:染色细胞数多于2/3.将染色强度和染色数量的级数相加，大于4者为阳性染色 ［7］ ，按此方法将前列腺癌组织切片分为阳性片和阴性片.P21蛋白主要定位于前列腺癌上皮细胞胞质中，呈现粗大的棕黄色颗粒状（Fig1）.Rb蛋白主要定位于前列腺癌细胞核和核膜上，阳性显色为棕黄色（Fig2）.P21，Rb的表达与病理分级、临床分期的关系见Tab1.P21与Rb共同表达阳性及阴性各有12例（33.3%），P21阳性而Rb阴性者7例（19.4%），P21阴性而Rb阳性者5例（13.9%）. 表1 P21CIP1/WAF1 和Rb在前列腺癌病理分级、临床分期中表达的关系（略）

　　3 讨论
　　
　　P21 CIP1/WAF1 是1993-11克隆出来的，是一种潜在的、广谱的细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin depen-dent kinases，CDK）的抑制因子［8］ .定位于人6号染色体短臂的2带1区（6P21.2），包括68bp，450bp和1600bp三个外显子，cDNA约为2.1kb，开放阅读框架长492bp，编码一个富含精氨酸的由164个氨基酸组成的蛋白质，相对分子质量21000.Rb基因是1986年由Dryja首先发现，其cDNA覆盖13q14区带大约200kb的范围，有27个外显子，转录成4.7kb的mRNA.相对分子质量110000未磷酸化蛋白是其产物中起抗癌作用的成份，而112000和114000磷酸化蛋白产物没有抗癌作用 ［9］ .
　　细胞增殖分化有赖于细胞周期活动，其中存在一些控制点或过渡期，控制着细胞周期的进展速度，其中以G1 /S，G2 /M及有丝分裂期的退出阶段尤其重要.细胞G1 /S进程依赖于cyclinE-CDK2，cyclinE-CDK4及cyclinD-CDK4的活性，Rb只有在G1 期为未磷酸化状态，它调控G1 期停滞作用只有在未磷酸化的状态下才能实现，磷酸化过程就是解除它的G1 期停滞作用的过程，在G1 /S期Rb的磷酸化又受cy-clin-CDK复合物的调节［10，11］ .而P21 CIP1/WAF1 可通过抑制这些激酶复合物的活性，使Rb处于未磷酸化状态而使细胞停滞在G 1 期，减慢G1 /S进程，直至受损的DNA得以修复，确保DNA下一轮复制时遗传物质的精确性 ［3，12］ .充当协调细胞周期转换、核查点控制的内部定时机制.一旦P21CIP1/WAF1 功能丧失，无论是由于基因突变或表达的改变，均可导致正常的周期控制能力丧失 ［2］ .

　　我们应用免疫组化SABC法观察36例人前列腺癌标本中P21 CIP1/WAF1 ，Rb表达产物的分布，结果发现P21表达阳性19例，阳性率52.8%，在肿瘤的不同病理分级中阳性表达不同，分化程度越低则阳性表达越低，存在显著性差异（P=0.0416），Ⅰ级阳性表达明显高于Ⅲ级.有文献报道P21在胃肠道、胃癌［13］ 及肝细胞肝癌［14］ 中起负性调节因子的作用，P21表达的缺失可能意味着肿瘤的迅速生长.我们的实验得出了类似的结论，表明P21基因可能与前列腺癌细胞的分化过程有关，它在前列腺癌的细胞生长中起负性调控作用，它的低表达使对Cyclin-CDK复合物活性的抑制作用减弱，在G1期停滞作用降低，使受损DNA修复能力丧失，以至细胞增殖处于失控状态.同时实验还表明P21蛋白的缺失可能是前列腺癌的晚期表现，它与前列腺癌的临床分期也有显著相关性，随分期的升高阳性表达降低，A-B期的阳性表达率明显高于C-D期，存在显著性差异（P=0.0023）.预示在强侵袭力的前列腺癌中，P21的缺失可能更为常见，即前列腺癌穿透包膜，侵及周围组织时，P21蛋白的表达较低，从而预示P21基因蛋白的缺失可能与前列腺癌的发展有关.Rb阳性表达17例，阳性率47.2%（17/36），与P21基因蛋白的实验结果类似，其阳性表达与前列腺癌分级呈负相关性（P=0.0385），Ⅰ级阳性表达明显高于Ⅲ级.由于它的缺失和突变而使Rb基因不能表达，或异常转录无功能的Rb蛋白，从而使抑制细胞周期由G1 向S期过渡的功能丧失，使肿瘤细胞在人体内形成肿瘤的能力升高，使人发病成为可能.同时，实验还表明Rb基因的表达与前列腺癌的病程发展有显著相关性（P=0.0374），高临床分期阳性表达较低分期低，预示着Rb基因伴随了前列腺癌的发生、发展，并与它的浸润及转移有关.
　　
　　P21 CIP1/WAF1 基因与Rb基因在调节细胞周期中关系紧密，但实验结果表明不支持它们之间存在显著相关性（P=0.5637）;进一步分析却发现在高分化癌中P21与Rb同时表达阳性较低分化多，而阴性表达病例正相反.这一规律同样在癌分期中也体现了出来，可能由于样本数量较少，未能在统计学上体现出来相关性，有待加大样本数量进一步研究证实.但至少提示在部分前列腺癌的发生中，二者的异常可同时存在并参与肿瘤的发生，并协同作用于肿瘤的进展.
　　肿瘤的生长调控很复杂，与多种癌基因、生长因子的内在相互关系有关，但就小范围来讲，在前列腺癌的分子发病机制中可能涉及到P21和Rb调节通 路的异常.作为抑癌基因，其应用有着广阔的前景，虽然抑癌基因在肿瘤治疗方面的疗效尚有待进一步观察，但有望成为继手术、化疗及放疗后一种较好的辅助治疗手段.同时，作为一种检测手段，对判定前列腺肿瘤的发生、进展及制定合理的治疗方案均可提供有价值的指标.
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