作者：张翠玲，刘立，任宇虹，周永清
【关键词】 脑缺血
关键词: 脑缺血;突触后致密物质;运动功能
摘 要:目的 研究大鼠缺血后，损伤区域及相关部位神经再塑与运动行为恢复之间的关系. 方法 线栓法建立大鼠的大脑中动脉缺血模型，术后7，14，21，28d，采用免疫组织化学方法观察突触素（SYN）及突触后致密物质-95（PSD-95）在大鼠皮层缺血灶的内侧、外侧、对侧的表达，触觉刺激试验作行为测试. 结果 SYN及PSD-95的免疫反应产物于术后7d在3个观察部位都显著减少，在14d以后明显增加，与此相对应的肢体活动在21d明显恢复. 结论 缺血损伤后的大鼠皮层梗塞区的内侧、外侧、对侧的神经再塑、突触重建与其肢体的功能恢复有着明确的相关关系.
Keywords:necotical ischemia;postsynaptic density;motor function
Abstract:AIM To evaluate the distribution and density of expression of proteins known to be involved in synaptognesis and to observe the motor function of forelimbs after focal is-chemia in rats.METHODS Unilateral cerebral ischemia was induced in rats by the middle cerebral artery occlusion（MCAO）.Synaptophysin and PSD-95were examined by im-munohistochemical techniques.Forelimbs function was eval-uated with tacticl stimulation test.RESULTS Both synapto-physin and PSD-95demonstrated statistically significant in-crease in the density of immunoreaction in the neocortical re-gions medial and lateral to the infarction as well as in the con-tralateral neocortex at14th day compared with sham con-trols.Meanwhile，forelimbs function recovery has statistically significant increased at21th day.CONCLUSION Change of neocortical structure was related to behavioral function recov-ery.
0 引言
神经系统功能定位学说曾经认为，脑的特定部位支配特定的功能，该部分损害即发生特定的功能障碍，排除了脑其他部分的参与.在脑神经不可再生理论的影响下，一旦出现脑损伤就认为是不可恢复的，从而造成了神经病学重诊断轻治疗的局面，阻碍了神经病学的发展.然而大量的基础研究以及临床实践证实脑损伤后功能是有可能或有条件恢复的，中枢神经系统存在着可塑性，目前人们对此的认识已逐渐从否认、争议、发展到了基本认同.那么脑损伤后，中枢神经系统功能恢复是通过什么机制完成?又以什么为基础?为回答该问题，我们进行了大鼠脑缺血损伤后的皮层突触再生与运动功能恢复的研究.
1 对象和方法
1.1 对象
实验动物为本校动物中心提供Spraque-Dawley（SD）大鼠，雄性，体质量（250±20）g.分为手术组和手术对照组，以术后第7，14，21，28日为观察时间点，n=6，共48只.采用插线的方法制造大脑中动脉梗塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型.用一细的线栓通过颈总动脉插入颈内动脉，并顺着颈内动脉向颅内推进18～23mm，即可造成大脑中动脉的完全阻断.神经症状评定分级:O级:未见行为缺陷;1级:前肢屈曲（即提尾悬空试验阳性）;2级:侧推抵抗力下降;伴前肢屈曲，无转圈行为;3级:同2级行为，伴自发旋转.手术组对照组的手术过程除不阻断动脉血流外，其余步骤均同手术组.
1.2 行为测试
采用触觉刺激试验（tactil stimula-tion test），方法为:对所有对照组大鼠及术后第7，14，21，28日的大鼠，在固定时间.将0.5cm×0.5cm的医用胶布粘于大鼠两前爪腹侧面后，送入观察箱中，记录其撕去胶布所使用的时间.
1.3 灌注与免疫组织化学染色
各观察时间点的大鼠，用10g・L-1 戊巴比妥钠（30mg・kg-1 ，ip）麻醉，40g・L-1 的多聚甲醛灌注固定，取大脑标本，连续冠状面切片，片厚40μm，0.01mol・L-1 KPBS清洗10min×3→浸入含3mL・L-1 Triton×100的0.01mol・L-1 KPBS液中30min→0.01mol・L-1 KPBS清洗10min×3→分别入突触素（Synaptophysin SYN1∶1000Sigma）或突触后致密物质（Post synaptic density-95PSD-951∶1000Santa Cruz Biotech，INC）一抗溶液，4℃下孵育24～48h;取出入0.01mol・L-1 KPBS清洗10min×3→分别入相应的二抗溶液（SYN Rabbit A-Rabbit1∶400;PSD-95Rabbit A-Goat1∶200），室温下孵育2h→0.01mol・L-1 KPBS清洗10min×3→浸入ABC复合物（1∶400Santa），室温下孵育2h，硫酸镍胺加强的DAB蓝色反应法呈色，同时用0.01mol・L-1 KPBS取代一抗做空白对照.贴片、脱水、透明、中性树胶封片.光镜观察.以Leica Q570C真彩色图象分析仪进行灰度定量分析，在损伤的内、外、对侧分别选5个高倍视野取测定数值减去背景测定数值的绝对值进行阳性物质密度值统计学分析，所有数据用x ±s表示，两
样本均数用t检验比较.
2 结果
2.1 行为学测试
大鼠前肢的功能在MCAO之后的第7日较之对照组明显降低，第14日有所恢复，于第21日较之损伤后恢复显著（P&<0.01），并基本接近正常（Tab1）.表1 大鼠前肢触觉刺激试验（略）
2.2 突触素（synaptophysin，SYN）
免疫反应产物的分布 在MCAO术后的第7日于梗塞区内、外和对侧顶叶皮质的SYN免疫反应复合物较之对照组明显减少，从第14日起及以后的几周这些部位的SYN显著增加（P&<0.01，Tab2）.对照染色均无SYN免疫反应复合物的出现.
2.3 突触后致密物质┐95（postsynaptic density┐95，PSD┐95）免疫反应产物的分布 与突触素的结果相似，PSD-95的免疫反应复合物在MCAO术后的第7日在梗塞区内、外侧和对侧顶叶皮质较之对照组明显减少，从第14日起以及以后的几周这些部位的PSD-95显著增加（P&<0.05，Tab2）.对照染色均无PSD-95免疫反应复合物的出现.表2 不同时间点在大鼠皮层不同部位突触素免疫反应复合物的灰度值（略）
3 讨论
在大量的临床实践中看到，中风患者的肢体偏瘫，经过训练、锻炼、药物治疗等可以逐渐部分甚至完全恢复.这就给我们以提示，中枢神经系统出现了某种代偿机制.当代神经病学家认为脑可以通过学习和训练完成因病损而丧失的功能，但脑必须具有重新获得的形态学基础.局灶性的皮层损伤可以作为一种去神经刺激（denervation stimulus），引发局部甚至远端的神经再塑［1］ ，包括代偿再生性发芽、突触再建等.
突触后致密物质（postsynaptic density，PSD）是突触后膜内侧胞质面有一层均质性的致密物质，其组成成分最初被认为主要是微管蛋白，以后证实除此之外，同时还有肌动蛋白、神经丝蛋白、Fodrin（钙调蛋白的一种主要成分）.PSD-95是组成兴奋性突触的突触后致密物质中的一个主要蛋白，它属于膜相关的鸟苷酸激酶（membrane-associated guanylate ki-nases，MAGUK）蛋白家族中的一员，存在于所有皮层结构中，包括小脑，大脑皮层和海马等，其他脑组织如:纹状体、丘脑同样有PSD-95的存在.在大脑皮层PSD-95分布在神经元胞体和神经树突的近端，在感觉运动皮层的第Ⅴ层的锥体细胞特别明显［4］ （Fig2）.神经递质的受体在突触后位点的准确簇集和被正确激活，是功能性突触形成时的基本需求.RAO等［5］ 的研究显示PSD-95与NMDA受体在突触后位点的准确蔟集和精确定位有一定关系.PSD-95和GKAP（与PSD-95相关的蛋白）首先形成的是一个突触后的骨架，随后谷氨酸受体亚单位附着于骨架上，共同调节突触的活动.此外，PSD-95对K+ 通道的簇集和定位［6］ 以及信号传导均有特异性的调节作用［7］ .PSD-95作为突触后膜的代表物质之一，在皮层损伤后的神经重建中有着与SYN相似的结果出现.通过本实验我们认为PSD-95可以作为神经再塑的一个指标.
由于我们实验中所造成的损伤部位是皮质的1区和2区，主要与前肢的感觉、运动有关，因此动物前肢感觉和运动的恢复与损伤后皮层的修复密切相关.从实验中我们可以看出，当皮层内突触形成的标志出现明显增加后，大鼠的前肢活动也出现显著的恢复提高，两者之间呈现出明显的相关性.肢体的恢复较皮层内结构的修复略迟缓，说明肢体的活动不仅与皮层有关，还与其他周围神经的联结及肌肉骨骼系统的恢复有关.
通过本实验我们认为，缺血损伤后的大鼠在损伤的皮层周围、对侧均可出现明显的神经修复再生，为肢体的功能恢复提供了结构基础，而且它们两者之间有着明确的相关关系.而到底是什么机制引起的?通过什么手段可以加强?还需要进一步研究.
致 谢 本实验得到神经生物教研室的饶志仁教授、陈良伟教授的热情指教.
参考文献
［1］Stroemer RP，Ken TA，Hulsebosch CE.Neocortical neural sprouting，synaptogenesis，and bebavioral recovery after neo-cortical infarction in rats ［J ］.Stroke，1995;26（11）:2135-2144.
［2］Wiedenmann B，Franke WW.Identification and locolization of synaptophysin，an integral membrane glycoprotein of Mr 38000characteristic of presynaptic vesicles ［J］.Cell，1985;41（3）:1017-1028.
［3］Eastwood SL，Burnet PWJ，McDonald B，Clinlon J，Harrison PJ.Synaptophysin gene expression in human brain:A quantita-tive in situ hybridization and immunocytochemical study ［J］.Neuroscience，1994;59（4）:881-892.
［4］Bassand P，Bernard A，Rafiki A，Gayet D，Khreslchalisky M.
Differential interaction of the tSXV motifs of the NR1and NR2NMDA receptor subunits with PSD-95and SAP97［J］.Eur J Neurosci，1999;11:2031-2043.
［5］Rao A，Kim E，Sheng M，Craig AM.Heterogeneity in the molecular composition of excitatory postsynaptic sites during development of hippocampal neurons in culture ［J］.Neuro-science，1998;18（4）:1217-1229.
［6］Fujita A，Kurachi Y.SAP family protein ［J］.Biochem Biophys Res Commu，2000;269（1）:1-6.
［7］Furuyashiki T，Fujisawa K，Fujita A，Madaule P，Uchino S，Mishina M，Bito H，Narumiya S.Citron，a Rho-target，inter-acts with PSD-95/SAP-90at glutamatergic synapses in the tha-lamus ［J］.Neuroscience，1999;19（1）:109-118.