作者：杜滂，魏经国，李和平，王耀程，邬秋珍，黄进
【关键词】 肝肿瘤
关键词: 肝肿瘤，内皮，血管;内皮生长因子;血管造影术
摘 要:目的 通过检测裸鼠肝癌模型中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达，观察血管造影的表现，探索VEGF与肝癌发生、发展之间的关系. 方法 将裸鼠25只平均分成5组，1组为对照外，其余20只原位种植人肝癌细胞，分别于1，2，3，4wk行动脉造影及用免疫组化的方法检测VEGF的表达. 结果 VEGF的表达与肝癌的发生、发展成正相关，术后1wk组VEGF表达成弱阳性，术后2wk组VEGF表达成阳性，术后3wk组及术后4wk组VEGF表达强阳性.血管造影显示术后两周组肝脏血管开始有增生及扭曲，3wk及4wk组血管改变更加明显. 结论 VEGF与肿瘤的生长、发展有密切的关系，血管造影显示为多血供的肿瘤VEGF表达较强.
Keywords:liver neoplasms，endothelium，vascular;endothe-lial growth factors;angiography
Abstract:AIM To study the role of VEGF in cancer devel-opment，progression，growth and metastasis.METHODS Twenty-five nude rats were pided into five groups.HCC-7712cells were planted in the liver of twenty nude rats.Then，we examined the concentration of VEGF in the livers after one week，two weeks，three weeks and four weeks re-spectively.At the same time，we made angiography of liver.RESULTS The relationship between VEGF and cancer de-velopment，progression，growth and metastasis was close.Angiography show vessels of liver became complicated.CONCLUSION VEGF is closely related to the develop-ment，growth，progression and metastasis of cancer.The more tumor vessels are seen，the higher the expression of VEGF may be.
0 引言
众所周知，肿瘤的生长、局部浸润、及远处转移与瘤血管的形成关系密切.人们发现血管内皮生长因子（VEGF）能提高血管的渗透性并促进毛细血管的生成.据报道，VEGF在许多人类肿瘤中都可表达，如:颅内的星形细胞瘤、鼻咽癌、肾癌、乳腺癌等等 ［1，2］ .多篇文献亦报道VEGF在肝癌中有过表达，但VEGF与肿瘤血管的形成之间的关系及机制并不十分清楚［3-7］ .在本研究中，我们将人的肝癌细胞HCC-7721原位种植于裸鼠肝脏内，采用血管造影的方法观察肿瘤进程中肝脏血管尤其是动脉的变化.分别于1，2，3，4wk取标本做HE及免疫组化染色，以观察原位种植肝癌的病理学改变与VEGF表达的关系，初步探索VEGF在肿瘤进程中的作用.
1 材料和方法
1.1 材料
裸鼠25只，鼠龄8wk，雌雄不限，体质量18～22g，无菌环境下饲养及手术操作.25只鼠分作5组，每组5只.试验组分别为正常对照组、术后1wk组、2wk组、3wk组和4wk组.10g L-1 戊巴比妥钠50mg kg-1 ip麻醉后，于右上腹切口，逐层分离暴露肝右叶，注入浓缩瘤细胞0.08～0.1mL，平均细胞数5×106 个，逐层缝合备用.自鼠尾静脉手推注入760g L-1 泛影葡胺0.5mL，1s注完，注射的同时开始拍片，拍片速度为每秒四幅.血管造影后，立刻剪开裸鼠胸腔，暴露心脏，用6号针头由左室进入主动脉，生理盐水30mL冲洗，40g L-1 多聚甲醛50mL灌注固定后，取出肝脏置于40g L-1 多聚甲醛中保存.
1.2 方法
组织切片HE染色.将所需标本取出，放入20g L-1 蔗糖液中浸泡24h，直至组织完全沉淀，冰冻切片机将标本切片，厚度为20μm，室温干燥后用0.01mol L-1 kPBS冲洗，置于含有3mL L-1 Triton X100的0.01mol L-1 kPBS内30min，再用0.01mol L-1 kPBS冲洗后加入anti-VEGF抗体，孵育24h后，依步骤加入二抗及显色剂.
2 结果
各组成瘤率均为100%，1wk组肉眼难以分辨病灶，镜下可见聚集成团的瘤细胞;2wk组5例中3例肉眼可看到小的瘤结节影，直径大小约0.5～3.0mm，数目2～7个;3wk组5例肉眼都可看到白色的瘤结节影，直径大小约1～10mm;4wk组中瘤结节更大，其中直径最大一例达16mm，分布更广泛和密集，相互间有融合，其中有2例肝脏明显变形变硬，此组裸鼠消瘦明显.
， 2.1 动脉造影
自尾静脉注入造影剂后，造影剂经下腔静脉至心脏，主动脉、腹主动脉、肝动脉依次显影.正常组5例均显示肝动脉各级分枝清晰、锐利，无扭曲及压迫征象.
术后1wk组5例中，3例显示与正常组基本相同，2例可在肝右叶见到一小类圆形低密度区，动脉期及静脉期均可见，未见明显瘤染色.
术后2wk组中，2例血管影像与正常组基本相同;2例可见散在的小点状高密度影;1例可见肝右前叶有一小团状血管影，其内血管走行较乱.
术后3wk和4wk中，2例造影失败外，8例肝内血管走行紊乱，以右叶为主.其中一例肝右前叶有大片坏死，临近坏死区可见一较大团状血管影，其内血管扭曲、紊乱，余肝内亦可见多个小团状血管形.
2.2 病理及免疫组化
正常对照组2例可见anti-VEGF抗体的阳性免疫反应产物.这些阳性反应主要集中在门静脉周围，但反应较弱.其余3例未见阳性反应结果.
术后1wk组光镜下可见瘤细胞聚集成团，但境界较清楚，未见明显包膜形成，聚集成团的瘤细胞主要集中在门脉分枝旁.瘤周肝细胞肿胀，可见少量巨噬细胞浸润.其中2例anti-VEGF抗体的免疫反应产物阴性，其余3例anti-VEGF抗体的免疫反应产物成弱阳性，阳性反应主要集中在瘤细胞膜及细胞质中，瘤周肝组织无阳性反应.
术后2wk组光镜下可见瘤细胞较术后1wk组者明显增多，瘤细胞团形状不规则，瘤周可见巨噬细胞浸润（Fig1），有些血管分枝产生向瘤细胞团突起的芽突.其中有2例anti-VEGF抗体的免疫反应产 物成弱阳性，3例anti-VEGF抗体的免疫反应产物成阳性，阳性反应主要集中在瘤细胞膜及细胞质中，瘤周肝组织无阳性反应（Fig2）.
术后3wk组光镜下可见瘤细胞明显增多，多个瘤细胞团向四周浸润，肝组织正常结构遭到破坏，一些血管中可见正在游走的瘤细胞.Anti-VEGF抗体的免疫反应产物成强阳性（Fig3）.阳性反应主要集中在瘤细胞膜及细胞质中，瘤周肝组织成弱阳性反应或无阳性反应.术后4wk组光镜下表现与3wk组基本相同，并可见大小不等的坏死区（Fig4），坏死区周围瘤细胞Anti-VEGF抗体的免疫反应产物成更强阳性.
3 讨论
肝癌是我国发病率最高的肿瘤之一，也是恶性程度最高、死亡率最高的肿瘤之一.它通常是在慢性肝损伤的基础上多中心起源的.在肝癌形成的早期阶段门静脉供血是肝癌生长的主要营养来源，随着肝癌细胞的生长，肝动脉供血占据了越来越来重要的地位.
对于恶性肿瘤来说，新生血管的形成与肿瘤的生长、局部浸润、远处转移密切相关.人们发现VEGF能提高血管的渗透性并促进毛细血管的生成，作为血管渗透因子，它可使血浆中的纤维蛋白原过饱和导致纤维蛋白析出成网状，形成细胞迁移的基础.作为血管内皮细胞生长因子，VEGF可促进血管内皮细胞增生，形成新生血管，其包含四种形式:VECF121 ，VEGF165 ，VEGF189 和VEGF206 .其中前两种是可扩散的，在人肝癌细胞中含量很高.据研究，在血管内皮细胞上至少存在着两种以上的VEGF的受体，现已知道的有flt-1，KDR.VECF121 及VEGF165 由肝癌细胞及肝星形细胞分泌，通过flt-1，KDR作用于血管内皮细胞［1，7，8］ .
关于VEGF的产生与肿瘤血管间的关系目前并不清楚，Mise等［3］ 发现VEGF mRNA在肝恶性肿瘤中有表达，其水平与肿瘤血管形成的程度密切相关.Takuji等［6］ 认为VEGF的表达与血管造影的结果一致.但Chow等［7］ 报道在只有约1/3的肝癌细胞中VEGF成阳性表达.Osama等［5］ 甚至报道约有0.59肝癌细胞中VEGF的表达与周围肝组织基本相同甚或更低.
我们采用免疫组织化学方法在肝癌生长1，2，3直至4wk，VEGF的表达逐步增高.术后1wk的肿瘤组织中的VEGF的表达较低，但可观察到大部分的瘤细胞集聚在血管周围;术后2wk以上可以看到成芽状突起的新生血管，在3wk及4wk的标本中可见到血管中游走的瘤细胞以及肿瘤中的坏死的区域，在这些坏死区域周围的瘤细胞VEGF的表达高于其他瘤细胞.在血管造影无异常改变的对照组及术后1wk组VEGF成弱表达甚至完全没有表达，此组内的瘤灶仅在光镜下可观察到;术后2wk组瘤结节增大，最大可达3mm，此组血管造影显示肝血管开始有所改变，VEGF的表达较高，其中1例有团状血管形成，VEGF的表达在此组内最高.随着瘤灶的进一步长大、融合，术后3wk及4wk组血管造影显示有大量的瘤血管形成，VEGF的表达在所有试验组中最高.本试验结果提示，肝癌病灶的生长、浸润与VEGF的关系及其密切.
［11］ 认为组织内氧含量的降低是血管形成的首要原因，Shweiki等和Plate等研究人的胶质细胞瘤后认为VEGF的表达随氧含量的降低而升高.Motohiro等［2］ 认为低氧含量下人脐静脉内皮细胞明显增殖，VEGF是缺血缺氧下最基本的血管因子.
病理学观察显示，在癌灶的发展过程中，瘤细胞膜及细胞质中VEGF表达逐步增高，其中又以肿瘤坏死区周围瘤细胞更为显著.这一现象提示VEGF与组织氧含量密切相关.肝癌在发展过程中对氧气及其他营养物质具有相当大的依赖性.在肝癌形成的早期阶段，主要依靠门脉供血，所以可见术后1wk组的瘤细胞聚集在门脉周围.随着肿瘤细胞不断生长，不断地在局部扩散，向远处转移，肿瘤细胞对氧的需求不断增高，由于周围组织提供氧的能力有限，肿瘤细胞的氧紧张度增加，VEGF合成增加，作用于血管内皮细胞VEGF的受体，从而间接促进新生血管形成.由于VEGF的血管渗透作用，部分瘤细胞穿过血管壁进入血管内向远处转移.坏死区周围的肿瘤细胞由于其氧紧张度最高，其周围瘤细胞的VEGF表达最高，术后四组中有1例瘤体最大并有大片坏死区，血管造影显示瘤血管增生非常明显，大量血管扭曲、变形，其VEGF的表达很高，尤其是坏死区周围瘤细胞.Takuji等［6］ 曾报道过人肝癌的恶性程度与VEGF表达成正相关关系，据其研究报道，肿瘤的恶性程度越高、肿瘤越大，肿瘤细胞内VEGF的含量也就越高，其原因可能是因为恶性度越高的肿瘤细胞对氧的需求量越高.
血管造影在临床上是一种能较早发现肿瘤的检查手段.本组试验中，血管造影的结果与肿瘤进展的程度成正相关.术后3wk以上血管造影均可明显观察到血管走形有纡曲甚至成团状.肿瘤生长的早期阶段对肝内血管影响较小时，血管造影不能有所显示.
总之，通过本试验我们可以看出VEGF在肿瘤的生长、发展过程中扮演着极为重要的角色.肿瘤细胞通过产生VEGF促使新生血管形成来满足自己对氧气及其它营养物质的不断需要.VEGF作用的具体机制仍需要我们进一步研究.
参考文献
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