大鼠AChR抗体致中枢受损与IL┐1和TNF┐α的有关性

　　　　 作者：苗建亭　李柱一　林宏　雷革胜　李宏增　宿长军　朱琳　游国雄

【关键词】 阿尔茨海默病
　　关键词: 阿尔茨海默病;β-淀粉样肽;氧化应激
　　摘 要:目的 探讨氧化应激在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）发病中的作用. 方法 参照Nabeshima方法，用立体定向方法将β-淀粉样肽（β-AP1-40 ，10μg）注入大鼠侧脑室建立大鼠AD模型，分别于1，2和3wk时测定血液和脑组织中过氧化氢酶（CAT）、总抗氧化能力（T-AOC）、胆碱酯酶（ChE）的含量及其学习记忆能力，并进行相关分析. 结果 β-AP注射后1wk，脑组织中ChE，CAT，T-AOC较对照组明显降低（10.1±4.1），（6.8±0.8）和（3.4±1.0）kU・g-1 （P&<0.01）.随时间延长，3wk时CAT和T-AOC下降越显著，机体的抗氧化能力越低（6.5±4.4），（2.0±1.2）和（2.4±1.2）kU・g-1 ，同时ChE的减少（6.5±4.4）kU・g-1 ，动物的学习记忆能力亦明显降低，且两者间呈正相关.而在外周血中ChE和CAT下降不明显（P&>0.05），T-AOC自1wk始较对照组呈下降趋势，至3wk时明显降低（6.8±1.2，P&<0.01）. 结论 β-AP能诱发氧化应激反应，在AD的形成过程中起着非常重要的作用，是AD形成的一个重要因素.
　　
　　
　　Keywords:Alzheimer’s disease;beta-amyloid peptide;oxida-tive stress
　　
　　Abstrat:AIM To investigate whether oxidative stress path-way takes part in the whole process formation of Alzheimer’s disease（AD）.METHODS The AD rat’s model was estab-lished by injection of beta-amyloid peptide（β-AP1-40 ，10μg）into cerebral ventricular system.CAT，T-AOC，ChE level and consecutive changes（1，2，3wk after injection）in brain tissue and peripheral blood were tested.RESULTS CAT，T-AOC，ChE level in brain tissue was significantly decreased at1wk than that of control group（10.1±4.1），（6.8±0.8）and（3.4±1.0）kU・g-1 （P&<0.01）.ChE，CAT and T-AOC were more decreased（6.5±4.4），（2.0±1.2）and（2.4±1.2）kU・g-1 （P&<0.01）.There is a positive relation be-tween them and memory impairment.However，no changes of ChE and CAT in peripheral blood（P&>0.05），T-AOC lev-el decreased from1wk to3wk ［（6.8±1.2）kU・g-1 ，P&<0.01］.CONCLUSION β-AP could evoke oxidative stress，which plays an important role and a key factor in AD forma-tion.
　　
　　0 引言
　　
　　β-淀粉样肽（beta-amyloid peptide，β-AP）是构成阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）脑特征性病变老年斑的核心成分，也是神经原纤维缠结以及血管淀粉样变性的生化基础［1］ .目前研究认为，β-AP引起的神经毒性作用似乎是AD发病的最终共同通路［2］ .但迄今为止，β-AP诱导AD脑神经元变性死亡的机制尚不清楚.近年来，氧化应激在AD发生中的作用已日益受到关注［3］ .我们采用β-AP注入大鼠侧脑室建立大鼠AD模型，进一步探讨氧化应激在AD发病中的作用.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 动物模型的建立:健康雄性SD大鼠25只，3～4mo龄，体质量200～250g（本校实验动物中心提供），随机分为实验组15只，对照组5只.1g・L-1 戊巴比妥钠麻醉大鼠（30mg・kg-1 ，ip）后，固定于立体定向仪上，头顶部正中切口，暴露前囟.参照Nabeshima［4］ 的方法，用微量注射器注入可溶性β-AP1-40 （RBI公司产品，美国）1μL（10μg・L-1 ）至侧脑室，坐标为:自Bregama点，后1.3mm，左1.3mm处为穿刺点，钻空穿颅（直径约1mm），自脑表面进针4.0mm至侧脑室.对照组注入等容积生理盐水.
　　1.2 方法 大鼠学习记忆测定法参照Stanes的方法.用三等分Y型迷宫箱进行测试.大鼠学习记忆成绩分别以其测试达到连续10次中有9次（9/10）正确反应时所需的电击次数表示.达9/10正确反应标准所需电击次数多少表示大鼠认知功能的优劣.分别于术前、术后进行测试［5］ .分别于1，2和3wk时，自心脏留取2mL血液.然后用200mL生理盐水灌注后，取脑并用分析天平称湿质量，按脑组织∶生理盐水0.5g∶1mL比例匀浆，与血液标本一起离心，3000r・min-1 ，15min，取上清液，冻存待测.过氧化氢酶（CAT）、总抗氧化能力（T-AOC）、胆碱酯酶（ChE）试剂盒由南京建成生物制品有限公司提供，由专业技师严格按照操作说明进行.
　　　
　　统计学处理:数据用x ±s表示，采用t检验和相关回归分析，并经SAS统计软件包处理.
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 各组学习记忆成绩 术前各组学习记忆能力基本一致（P&>0.05）.对照组始终未出现学习记忆障碍（P&>0.05）.而实验组术后1，2和3wk所需电击次数较术前和对照组明显增加（P&<0.01，Tab1），出现学习记忆障碍.
　　
　　表1 大鼠Y型迷宫学习记忆成绩　略
　　　　
　　2.2 外周血ChE，CAT，T┐AOC β-AP注射后1和2wk时外周血中CAT下降不明显（P&>0.05），而在3wk时显著下降（P&<0.05）.自1wk始T-AOC较对照组呈下降趋势，至3wk时明显降低（P&<0.01），与学习记忆成绩呈负相关（r=-0.6731，P&<0.05）.而ChE始终无明显变化（Tab2）.
　　
　　2.3 脑组织ChE，CAT，T┐AOC β-AP注射后1wk，脑组织中ChE，CAT，T-AOC下降（P&<0.05）;2和3wk时ChE，CAT，T-AOC较对照组明显降 低（P&<0.01），与学习记忆成绩呈负相关（r=-0.8962，0.6753，0.8649，P&<0.01，Tab3）.
　　
　　表2 血清ChE，CAT，T-AOC变化　略
　　
　　表3 脑组织ChE，CAT，T-AOC变化　略
　　
　　3 讨论
　　
　　AD是一种多原因引起，涉及多种病理机制和出现多种病理表现的“多因异质性疾病”［1，6，7］ .越来越多的证据表明，β-AP是各种原因诱发AD的共同通路，是AD形成和发展的关键因素.目前多数学者认为，β-AP在大脑皮层内的蓄积是AD病理发生过程中的一个早期必然事件，超前于其他脑区损伤和临床症状数年［8］ .在发生顺序上，β-AP的出现早于神经纤维缠结、轴索缺乏营养等病理变化以及临床症状.β-AP在一定条件下能表现出神经毒性，一是增强或放大各种伤害刺激如低血糖、兴奋毒素、自由基等的细胞损伤效.二是直接的细胞毒性.β-AP的神经毒性涉及到复杂的分子机制，主要包括促进自由基的形成、破坏细胞内的Ca2+ 稳态，降低K+ 通道的功能，增加致炎细胞因子引起的炎症反应［9，10］ .

　　近年来，有关氧化应激过度与自由基毒性在AD发病中的重要作用已成为人们研究的焦点［11］ .本结果表明，β-AP注射后2，3wk，脑组织中ChE，CAT，T-AOC较对照组明显降低.中枢胆碱能系统是维持高级神经功能活动 记忆、思维和智能的重要介质，脑组织中ACh代谢酶 ChE活性含量下降则提示机体内中枢胆碱能系统的功能降低.随时间延长，CAT和T-AOC下降越显著，机体的抗氧化能力越低.同时ChE的减少，动物的学习记忆能力亦明显降低，且两者间呈正相关，这说明氧化应激是AD形成的一个重要因素.而在外周血中ChE和CAT下降不明显，T-AOC自1wk始较对照组即呈下降趋势，至3wk时明显降低.随时间延长，机体的抗氧化能力下降，动物的学习记忆能力亦明显降低，且两者间呈正相关.这表明在AD的形成过程中，氧应激起着非常重要的作用.在正常情况下，自由基的产生和消除的速率维持着一种动态平衡，氧应激的产生过程是这种平衡被打破的过程，这种平衡的破坏可被β-AP肽段等因素诱发［12］ .活性氧（如・OH）大多能促使蛋白过氧化、脂质过氧化及核酸过氧化，在线粒体有氧呼吸过程中产生的超氧阴离子，进一步形成羟自由基（.OH）等活性氧，引起线粒体损伤;线粒体功能紊乱改变了淀粉样蛋白的代谢过程，使得AD患者脑中出现了淀粉样变性，AD线粒体损伤导致了氧应激加剧.β-AP诱导的转录因子NF-kB活性的阻断和钙离子浓度升高同线粒体功能缺损有关，β-AP诱导的线粒体功能缺损包括线粒体膜的去极化、氧消耗减少和组成线粒体电子传递键的复合物1，II，III的功能阻断;β-AP能引起线粒体活性氧的产生，诱导早老性AD的发生［13-15］ .AD中线粒体的损伤与氧应激是密切相关的，AD中的线粒体受到损害能产生氧应激，而氧应激又加剧线粒体的损害作用，AD可能正是这两种因素相互作用的结果.
　　参考文献:
　　
　　［1］Markesbery WR.Oxidative stress hypothesis in Alzheimer’s disease ［J］.Free Radic Biol Med，1997;23（1）:134-147.
　　［2］Butterfield DA.Beta-Amyloid-associated free radical oxidative stress and neurotoxicity:Implications for Alzheimer’s disease ［J］.Chem Res Toxicol，1997;10（5）:495-506.
　　［3］Butterfield DA，Howard B，Yatin S，Altern T，Kubert HU.El-evated oxidative stress in models of normal brain aging and Alzheimer’s disease ［J］.Life Sci，1999;65（18）:1883-1892.
　　［4］Nabeshima T.Trial to produce animal model of Alzheimer’s dis- ease by continuous infusion of beta-amyloid protein into the rat cerebral ventricle ［J］.Nihon Shinkei Seishin Yakurigaku Zasshi，1995;15（5）:411-418.
　　［5］Miao JT，You GX，Wang ZJ.A study of the relationship be-tween hypomnesia and cholinergic neurons of hippocampus in vascular dementic rats ［J］.Zhonghua Laonian Yixue Zazhi（Chin J Geriatr），1997;16（6）:327-330.
　　［6］Yatin SM，Aksenova M，Aksenov M.Temporal relations a-mong amyloid beta-peptide-induced free-radical oxidative stress，neuronal toxicity，and neuronal defensive responses ［J］.J Mol Neurosci，1998;11（3）:183-197.
　　［7］Lu YL，Lu K，Chen ZM，Fu XF.Changes of neuropeptide in serum and CSF of muti-infarct dementic patients ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（6）:566-567.
　　［8］Yao ZX，Drieu K，Szweda LI，Ziydet K.Free radicals and lipid peroxidation do not mediate beta-amyloid-induced neuronal cell death ［J］.Brain Res，1999;847（2）:203-210.
　　［9］Zhu ZH，Xiong LZ，Dong HL，Hu WN，Hou WC.Isoflurane preconditioning induces ischemic tolerance in MCAO rats ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（5）:474-478.
　　［10］Butterfield DA，Yatin SM，Varadarajan S，Maretunt JT，Lon-bert F.Amyloid beta-peptide-associated free radical oxidative stress，neurotoxicity，and Alzheimer’s disease ［J］.Methods Enzymol，1999;309（6）:746-768.
　　［11］He YD，Fei Z，Zhang X，He XS，Li SH，Liang JW.Gene ex-pression of metabotropic glutamate receptor1a after brain injury and efficacy of its antagonist MCPG ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（7）:612-615.
　　［12］Imao K，Wang H，Komatsu M，Maxert Y，Cogertuk R.Free radical scavenging activity of fermented papaya preparation and its effect on lipid peroxide level and superoxide dismutase activi-ty in iron-induced epileptic foci of rats ［J］.Biochem Mol Biol Int，1998;45（1）:11-23.
　　［13］Fu ZY，Ma RS.Both circadian rhythm and repeated-testing act on event related potential P300［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（2）:110-112.
　　［14］Behl C，Holsboer F.Oxidative stress in the pathogenesis of Alzheimer’s disease and antioxidant neuroprotection ［J ］.Fortschr Neurol Psychiatr，1998;66（3）:113-121.
　　［15］Tao FS，Zhang JL，Mei GT，Li YQ.Projection of serotoniner-gic neurous to the trigeminal motor nucleus and sensory nucleus ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（11）:1321-1324.