作者：汪静 王连刚 武胜昔 邓敬兰
【关键词】 受体
关键词: 受体;生长抑素;垂体腺瘤
摘 要:目的 研究生长抑素受体1，2亚型在不同病理类型垂体腺瘤中的表达特性. 方法 运用原位杂交技术，以放射性核素标记SSTR1-2亚型的寡核苷酸为探针，检测29例垂体瘤、12例正常垂体组织中SSTR1，2mRNA的表达模式. 结果 SSTR1，2亚型同时表达于功能型、无功能型垂体瘤及正常垂体组织中，它们的阳性率分别为100%，79%，33%和100%，86%，25%;其中SSTR2表达的强阳性率较高（52%）. 结论 垂体腺瘤可同时表达两种生长抑素受体亚型，因此它具有接受受体介导的生长抑素类似物靶向治疗的乐观前景.
Keywords:receptor;somatostatin;pituitary adenoma
Abstract:AIM To investigate the characteristics of expres-sion and distribution of2subtypes of somatostatin receptor（SSTR1-2）mRNA in pituitary adenoma.METHODS With ［α-35 S］dATP labeled oligonucleotide of the2SSTR subtypes as probe，using in situ hybridization，patterns of mRNA ex-pression were detected in29pituitary tumor cases and12nor-mal pituitary tissues.Additionally，semi-quantitative analysis of the densities of the expression were estimated.
RESULTS Two SSTR subtypes were heterogeneously expressed in dif-ferent pituitary adenoma cell types and normal pituitary tis-sues.The positive rate was100%，79%，33%and100%，86%，25%in functioning，nonfunctioning pituitary and nor-mal pituitary tissues，respectively.The densities of SSTR2expression were dominant in29cases than those of SSTR1.There were significant differences of positive rate between the pituitary tumors and normal pituitary tissues.CONCLUSION Somatostatin analog-oriented agents have a potential for the treatment of pituitary tumors.
0 引言
生长抑素受体（somatostatin receptor，SSTR）及其亚型在垂体腺瘤组织上的分布与表达，国外起步于1995年［1，2］ ，而国内尚未见相关的报道.我们采用放射性核素标记探针的原位杂交技术，检测SSTR1及SSTR2这两种亚型在不同病理类型垂体腺瘤中的表达特性，并与正常垂体组织的表达进行对照，为受体介导的靶向治疗提供实验依据.
1 材料和方法
1.1 材料 垂体腺瘤组织来源于本校西京医院手术切除标本，其中功能型腺瘤15例，无功能型腺瘤14例.正常垂体组织切片12例，由维也那大学的Vir-golini教授惠赠.标本经生理盐水清洗，迅速置于液氮中速冻，-80℃中备用.
1.2 方法
1.2.1 寡核苷酸探针的制备 所用2种寡核苷酸分别与SSTR1，2亚型mRNA的一段相反义，并依次对应于SSTR1，2亚型的第252～267，237～252氨基酸序列［3］ :SSTR1:ATG GTG GCC CTC AAG GCC GGC TGG CAG CAG CGC AAG CGC TCG GAG CGC;SSTR2:TCC TCT GGA ATC CGA GTG GGC TCC TCT AAG AGG AAG AAG TCT GAG AAG.探针由北京赛百盛（美国）生物工程公司（CyberSyn，BJ）的Applied Biosystems381A型DNA合成仪合成.
1.2.2 寡核苷酸探针的标记 采用［α-35 S］dATP（&>37Bq・mol-1 ），由中国同位素总公司订购的英国Amersham公司的产品为标记原料，用3’-末端标记法对上述2种探针分别进行标记，反应终止后用核苷酸纯化柱纯化产品［4］ .
1.2.3 原位杂交程序［5］ 将预先冻存的组织块移入恒冷箱切片机中进行切片（10～15μm），并将所需的切片贴在经明胶处理的载玻片上.取快速干燥的组织切片，置40g・L-1 多聚甲醛固定20～30min，用0.1mol・L-1 PBS冲洗及杂交前处理液处理，再经系列乙醇、氯仿脱水、脱脂.杂交时将200μL杂交液、15μL DTT及标记探针（5.92～8.88MBq）滴加到切片表面，湿环境中孵育24h（37℃）.杂交后，用1×SSC冲洗切片，然后行脱水干燥.最后将核乳胶涂在切片表面，置暗盒中曝光（4℃）.4～6wk后用Kodak D19显影液显影，F-5坚膜定影液定影，水洗后经硫堇复染、脱水、透明后，用中性树胶封片，在光镜下明、暗视野观察.
1.2.4 竞争性对照试验 随机抽取每例垂体腺瘤的部分切片经常规杂交前处理后，用含过量的未标记探针的杂交液进行预孵育，冲洗后，再用含标记探针的杂交液进行杂交.
1.2.5 半定量分析 从每种肿瘤组织标本中，随机选4张切片，进行细胞计数.按杂交信号的有无和阳性细胞的多少分3个等级:阴性（-）:切片中无阳性细胞;阳性（+）:切片中阳性细胞占细胞总数的50%以下;强阳性（）:切片中阳性细胞在50%以上.
2 结果
2.1 SSTR1，2亚型探针的放射 放射性核素［α-35 S］dATP与SSTR1，2亚型探针的标记完成后，采用Quick-count2000小型放射性同位素测量仪（Bios-cun公司）测得各标记探针的放射性计数，并将其换算成放射性比活度，结果为:SSTR1标记探针的放射性比活度为99.9GBq・mg-1 ，SSTR2标记探针的放射性比活度为86.7GBq・mg-1 ，均达到实验要求.
2.2 SSTR1，2亚型mRNA的分布 2种受体亚型分子的mRNA主要分布于垂体组织中的主质细胞上，且位于其细胞膜表面，细胞核及细胞质内未见阳性颗粒，这说明生长抑素受体属于膜受体的一种.阳性细胞的表面有深色细小颗粒聚集，且颗粒密度大于本底5倍以上（Fig1）.
2.3 SSTR1mRNA的表达及半定量分析 SSTR1mRNA在功能型、无功能型垂体腺瘤和正常垂体组织中表达的阳性率，分别为100%，79%和33%（Tab 1）.其中强阳性的例数占总阳性例数的38%（10/26）.
图1 略
表1 SSTR1mRNA在垂体腺瘤组织中的表达 略
2.4 SSTR2mRNA的表达 41例标本中，SSTR2mRNA表达呈强阳性的例数占总阳性例数的52%（14/27，Tab2），综上结果，虽然不同病理类型的垂体腺瘤组织中均有SSTR1，2的共同表达，但两者相比，SSTR2的表达密度高于SSTR1的表达密度，这也表明垂体瘤对SSTR2亚型受体特异性的配体的治疗效果会较好.竞争性对照试验:结果在垂体腺瘤组织中未发现阳性的杂交信号，说明本实验所用探针的特异性强，与预封闭的瘤靶组织无非特异性杂交.
3 讨论
生长抑素及其类似物通过SSTR各个亚型的介导，神经系统内的神经递质或神经调节肽作用，在外周组织直接或间接抑制肿瘤细胞的增殖和分化［6-8］ .通常认为，生长抑素受体主要分布在APUD瘤系统中，但近年的研究表明，SSTR还存在于乳腺癌、淋巴瘤、小细胞肺癌以及垂体腺瘤等非APUD瘤系统的组织当中［9，10］ .1995年，SSTR的5种亚型已先后克隆成功，对5种亚型结构与功能的研究方兴未艾.学者们认为其中1，2亚型的表达与分布在肿瘤的发生和发展中起重要作用［11］ .生长抑素类似物（somatostatin analogy，SSA）通过1，2亚型，尤其是2亚型的介导发挥着抑制肿瘤细胞增殖和异常分泌的作用［12］ .
我们的研究表明，无论是功能型，还是无功能型的垂体腺瘤中，SSTR1及2亚型均同时表达，并且这种表达是非均匀性的，其中功能型2种亚型的阳性率达到100%，SSTR2在两种垂体腺瘤中的强阳性率高于SSTR1，它们分别与正常垂体组相差具有统计学的意义.由此可见，SSTR1，2亚型较为广泛地存在于垂体腺瘤组织中，而且SSTR2具有较高的表达强度，这与SSTR2可能参与垂体腺瘤的自分泌调控有关［13］ .令人感兴趣的是，SSTR2与产生抑制激素异常分泌作用的Octreotide有较高的亲和力［14］ .SSTR2的分布及其数量与Octreotide的疗效间有着良好的相关性［15］ .本组SSTR1，SSTR2mRNA在两种垂体腺瘤组织中的表达阳性率虽有一定的差别，但无统计学意义，可能是因为它们在垂体腺瘤组织中的表达与其组织学类型无关，也可能是研究的病例数较少所致，尚待进一步研究.
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