关于家兔胸部火器伤后各组织中TNF┐α表达意义

作者：郭建军　刘维永　卢春蓉　刘慧

【关键词】 胸部
　　关键词: 胸部;火器伤;肿瘤坏死因子;免疫组化
　　摘 要:目的 用免疫组织化学方法检测家兔胸部火器伤后各组织中TNF-α的表达，探讨其伤后表达变化规律. 方法 64只家兔随机均分8组，除正常对照组外均用5.56mm小口径步枪距离6m射击兔右下胸第八肋间锁骨中线外1cm处造成前后胸贯通伤，经指袢排气及消毒缝闭胸壁伤口等简单救治，致伤7组家兔分为伤后0.5，1，6，24和72h，7d，30d取材组，每只均取伤肺距伤道2mm处、1cm处、邻叶中部、与伤道对应的对侧肺处、左室壁、肝、肾、脑、垂体、肾上腺取组织标本，行免疫组织化学染色检测组织TNF-α表达. 结果 伤后0.5h各组织中TNF-α表达即升高（P&<0.01），6h已达高峰，持续数天，7d后降低，30d后与伤前无明显差别.不同时间组同一组织TNF-α表达定位基本相同，而表达强度有所不同. 结论 家兔胸部火器伤后各组织中TNF-α表达明显升高并与损伤时间密切相关，同一组织TNF-α表达定位基本相同.TNF-α在各组织中表达强度一定程度上反映了动物伤情.

　　
　　Keywords:chest;firearm injury;TNF-α;immunohistoche-mistry
　　
　　Abstract:AIM To investigate the expression of tumor necrosis factor-αin some rabbit’s tissues after being shot　through the thoracic cavity by5.56mm caliber rifle-gun.METHODS 7of8groups rabbits were wounded and1was normal group，2mm×2mm×2mm tissues were cut from such spots like2mm and1cm far from the trajectory，ad-joining lobe and opposing lobe，left ventricle of heart，liver，kidney，brain，pituitary gland，adrenal gland respectively at the time that0.5h，1h，6h，24h，72h，7d，30d after be-ing shot，and investigated these tissues’expression of TNF-αthrough immunohistochemistry.RESULTS The expression of TNF-αimproved from the time of0.5h after being shot，reached peak at6h and kept on for days and then reduced from1wk after being shot，recovered to normal30d after being shot.For example，TNF-αmainly lied in typeⅠandⅡalveolar cells and capillary endothelium and neutrophilic-granulocytes in lung，and in trajectory of wounded lobe&>in contusion area of wounded lobe&>in adjoining lobe&>oppos-ing lobe（P&<0.01）;mainly lied in hepatocytes，Kupffer cells and hepatic sinusoid’endothelium and so on.CONCLUSION There was a regular improvement and mostly same spots of the expression of TNF-αin kinds of tissues and it could re-flect the seriousness of injuries in a way in firearm injury to rabbit’s chest.
　　
　　0 引言
　　
　　胸部火器伤在平战时发生率均较高，伤情重，死亡率高［1］ .由于动物模型不好建立，就其发病机制方面的研究不多，且主要集中在投射物引起的瞬间压力变化和伤后早期的改变，缺乏对其发病机制的深入了解.本实验在成功建立了胸部火器伤动物模型的基础上［2，3］ ，进一步观察伤后各组织中TNF-α变化，探讨TNF-α在火器伤发生发展中可能起到的作用.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 家兔64只，本校实验动物中心提供，体质量（2.5±0.25）kg，雌雄不限，随机均分8组，分别为正常对照组、伤后0.5，1，6，24和72h，7和30d活杀取材组.5.56mm小口径步枪，弹丸质量m=2.57g，撞击速度v=（340±25）m・s-1 .TNF-α一抗购自军事医学科学院，二抗、ABC酶标及DAB棕色显色合采自Sigma公司.
　　
　　1.2 方法 各组兔均用30g・L-1 戊巴比妥钠30mg・kg-1 经耳缘静脉麻醉，右胸壁脱毛后左侧卧位固定于动物台上，距离6m射击兔右下胸第八肋间锁骨中线外1cm处，造成前后胸贯通伤，伤后立即行指袢排气及消毒缝闭胸壁伤口等简单救治.致伤各组活杀后分别取伤肺距伤道2mm处、1cm处、邻叶中部、与伤道对应的对侧肺处、左室壁、肝、肾、脑、垂体、肾上腺取组织标本2mm×2mm×2mm，正常对照组组织取材部位与伤组相对应，免疫组织化学方法检测TNF-α的表达.光学显微镜下观察各组织免疫组化染色结果，leica图像分析仪检测TNF-α的表达强度，特异信号强度I=A背景区 /A测定区 ，A背景区 为背景区平均光密度，A测定区 为测定区平均光密度，公式中A为光密度，从0～255.若I值为1，说明测定区信号强度与背景区相同，指示无特异性染色;I值越大说明特异性染色越强.
　　
　　统计学处理:数据用x ±s表示，用SPSS统计软件处理，行方差分析及组间比较.
　　
　　2 结果
　　
　　免疫组化结果显示与正常组比较，伤后0.5h各组织中已有TNF-α的表达（P&<0.01），肺组织以原发伤道2mm范围内最为显著，主要集中在间质内中性粒细胞、枯否细胞及单核细胞中，肺泡Ⅰ型细胞及Ⅱ型细胞胞质中有中量表达，肺泡腔内有少量表达是漏出的血细胞所致，伤叶2mm～1cm区域、邻叶、对侧叶内TNF-α表达依次减弱.1h各区域表达均明显提高（P&<0.01），但仍以1cm以内区域最为显著，邻叶及对侧叶表达仍稍弱但二者之间无明显差异，6h各区域表达达峰值，24h与6h无明显差别，72h时表达已较24h时有所减弱，7d时仅原发伤道周边区域（r&<5mm）有较弱表达，余区域未见阳性结果，30d时各区域无阳性表达.心肌细胞胞质及间质内血管内皮细胞胞质内于伤后0.5h即有少量TNF-α表达，出血局灶内中性粒细胞、巨噬细胞及单核细胞内已有少量表达，6h各区域表达达峰值，24h与6h相比程度及范围无扩大，72h时表达已较24h时有所减弱，3d时心肌细胞胞质内表达已较弱，血管内皮细胞胞质及出血局灶内中性粒细胞、巨噬细胞及单核细胞内仍有少量表达，7d时仅出血局灶内中性粒细胞、巨噬细胞及单核细胞内已有少量表达，余区域未见阳性结果，30d时各区域无阳性表达.肝细胞 转贴于 于0.5h可见胞质内有少量表达，细胞间微血管内皮 细胞内未见明显表达，但肝细胞病变比较弥漫、程度均匀，尚未见局灶性病变区，肝小叶血窦内枯否细胞胞质内表达强于其周围肝细胞（P&<0.05），伤后6h肝细胞胞质内阳性表达达峰值，并开始出现局灶性出血坏死区，紧接坏死区周边的肝细胞内TNF-α表达明显强于其他区域（P&<0.01），此时血窦内血管内皮细胞胞质内开始出现TNF-α阳性表达，但程度较弱，24h病变无进一步加深，3d后各部位表达开始逐渐减弱，到7d时仅少数局灶病变周边肝细胞及血窦内枯否细胞内有少量表达，30d时各区域未见阳性表达.肾脏是伤后TNF-α表达最强烈的器官，伤后0.5h及可见肾小球内皮细胞和足细胞近曲小管细胞、远曲小管细胞、集合管细胞胞质内均可见阳性表达，并随时间逐步加强，伤后6h到72h各部位均呈强阳性表达（P&<0.01），72h时虽程度减弱但仍呈阳性，7d时各部位有弱阳性表达，30d时仅远曲小管细胞、集合管细胞胞质内可见弱阳性表达，肾小球细胞、近曲小管细胞胞质内表达已不明显.大脑皮质六层阳性表达不尽相同，主要集中在内颗粒层的星型细胞和节细胞层的锥体细胞中，其他分层及穿行纤维中亦有表达，但程度较弱，丘脑阳性表达主要集中在视上核和室旁核中大细胞神经元胞质内（0.5h～7d），正中隆起和其他核团内有少量表达.垂体中腺垂体内阳性表达主要集中在嗜碱性细胞和嗜酸性细胞及滤泡细胞胞质中（0.5h～7d），而嫌色细胞胞质内未见明显阳性表达，垂体中间部滤泡细胞胞质内有明显阳性表达，其周围的嗜碱性细胞胞质内亦有阳性表达但强度较弱（0.5h～7d）.神经垂体内可见阳性表达呈线状分布在无髓纤维的轴质内，膨体内亦可见片状及颗粒状阳性表达（0.5h～3d）.肾上腺阳性表达主要集中在皮质束状带细胞胞质中，球状带及网状带细胞胞质阳性表达较弱，髓质嗜铬细胞胞质中亦有阳性表达（0.5h～7d）.伤后不同时间组各组织内TNF-α表达强度（I）比较有差异（Tab1）.
　　
　　3 讨论
　　
　　TNF-α是一种作用广泛的细胞因子，其生物学作用可有使PMN自髓释出、促发其移动、穿越内皮及活化，包括PMN粘附、脱颗粒及呼吸爆发、释放蛋白酶和氧自由基;激活MΦ 分泌IL-1，刺激T细胞和VEC产生IL-6，IL-8;活化MΦ 和VEC内花生四烯酸代谢，产生白三烯;直接作用于VEC，损伤VEC使血管功能紊乱和血栓形成、血管活性物质释放;使溶酶体酶外泄直接杀伤靶细胞;促进T细胞和其他杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤［4，5］ .目前人为TNF-α是ALI和SIDS的启动因子，通过启动细胞因子群导致炎症反应的发生［6，7］ .本实验中TNF-α于伤后0.5h在各组织中表达既有明显升高，病理解剖中除原发伤道出血水肿严重外，其他组织也有不同程度的水肿及出血，TNF-α伤后6h达峰值时各组织损伤表现也达高峰，伤后72h各组织中TNF-α表达开始降低，此时组织也进入恢复阶段，水肿减轻，渗出开始吸收，出血范围及程度也逐步减少减轻，伤后1wk，TNF-α表达与伤前比差别不明显，各组织结构功能基本接近正常，伤后30d，TNF-α除在个别继发感染处有表达外，余处已无表达，说明炎症反应已基本停止，各组织进入恢复阶段.可见在胸部火器伤中，TNF-α不仅参与伤后炎症反应的启动，还参与整个炎症反应过程.
　　
　　表1 伤后不同时间组各组织内TNF-α表达强度（I）比较　略
　　　　
　　胸部火器伤中TNF-α表达及作用特点有，范围广:实验结果显示不仅原发伤肺叶组织TNF-α表达强烈，且临近器官如邻叶和对侧叶，远隔脏器如肝、肾、脑甚至垂体及肾上腺均有不同程度表达;出现早、峰值高、持续时间长:伤后0.5h各组织既有明显表达，与伤前相比均有显著差异（P&<0.01），说明在原发损伤刺激下TNF-α的激活和释放十分迅速;多个组织TNF-α表达高峰期可达伤前3～5倍，如此明显的变化说明TNF-α在局部炎症反应中扮演着重要角色;伤后1wk一些组织尚有TNF-α表达表明它不是简单的启动因子，而是自始至终参与了整个过程.程度不一:定量分析表明各组织表达程度变化大小不一，伤叶中以原发伤道最为强烈，向外依次减轻，同一时间点，原发伤道TNF-α表达可以是一些远隔组织表达的2～3倍，表明子弹的切割牵扯造成的组织挫伤是最直接和有效的激发因素，而邻叶和对侧叶虽无直接损伤，但邻叶表达明显高于对侧叶，说明组织所受震荡及挤压在刺激TNF-α表达上也能起到一定作用.富含血液器官如心脏、肝脏及肾脏和脑，不仅有TNF-α广泛表达，且均有肉眼下点状或片状出血点，光镜下也显示出血点区域及周边TNF-α表达强于同组织的其他部位，而出血区域相对规律地重复出现，提示它的发生应与血液分布特点有某种关系，这方面正在进一步研究之中.
　　参考文献:
　　
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　　［2］Guo JJ，Liu WY，Cai JH.Establishment of animal model and study the early death causes in rabbit’s thoracic firearm wound ［J］.Zhongguo Xiongxin Xueguan Waike Linchuang Zazhi（J Chin Thorax Cardio Surg），1998;5（2）:73-75.
　　［3］Guo JJ，Liu WY，Cai JH.Parameters and establishment of ani-mal model in rabbit’s thoracic firearm wound ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（5）:527-529.
　　［4］Spooner CE，Markowitz NP.The role of tumor necrosis factor in sepsis ［J］.Clin Immunopathol，1992;62:S11.
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　　［7］Balkwill FR，Burke F.The cytokine network ［J］.Immunol To-day，1989;10（9）:350.