作者：原卫清 王颢 吕卓人 陈萍 韩骅 牛利国
【关键词】 钠泵抑制物
关键词: 钠泵抑制物;噬菌体展示技术;抗体
摘 要:目的 应用噬菌体展示技术构建钠泵抑制物单链抗体库. 方法 用OUA-OVA（ouabain-ovalbumin）免疫小鼠，取脾脏，分离淋巴细胞，提取mRNA，逆转录成cDNA第一链，用简并引物经PCR分别扩增轻、重链抗体库，经重叠延伸PCR由Linker将轻、重链拼接成ScFv（单链抗体），用RS引物以ScFv为模板进行第2次PCR，同时在5’及3’端分别加上SfiI，NotI酶切位点.经SfiI，NotI酶切后，在T4连接酶的作用下将ScFv与pCANTAB5E噬菌粒连接，电转化进入TG1大肠杆菌，挑取12个单菌落提取质粒用EcoRⅠ和HindⅢ进行酶切鉴定，后经M13KO7辅助噬菌体拯救，离心收集上清即为全套ScFv基因的噬菌体表面展示文库. 结果 以OUA-OVA免疫小鼠，检测血清中抗体效价可达（1 2×106 ），用通用引物分别扩增出轻、重链片段的大小为325bp和340bp，将两者拼接得到约720bp大小的单链抗体库，以8×1011 的转化效率转染TG1细胞，EcoRⅠ和HindⅢ酶切后，12个单菌落所提噬菌粒DNA中有10个切出了约为2.1kb的目的条带，所构建的噬菌体抗体库库容量约为1.2×108 .经M13KO7超感染后，测噬斑滴度为9×1014 pfu L-1 . 结论 成功地构建了钠泵抑制物噬菌体单链抗体库.
Keywords:ouabain;phage display;antibodies
Abstract:AIM To construct a ouabain ScFv（single chain fragment variable）antibody library by phage display.METHODS Mice were immunized by OUA-OVA（ouabain-ovalbumin）.mRNA was isolated from the spleen lymphocyte and reversely transcripted.The heavy-chain and kappa light-chain variable region genes（VH and VL ）repertoirs of im-munoglobin were amplified inpidually and assembled into ScFv by a linker with overlap extension PCR.ScFv was reamplified with RS primer，meantime SfiI and NotI restric-tion sites were added to the ScFv different ends.ScFv was di-gested by SfiI and NotI，and cloned into the phagemid pCANTAB5E and introduced into E.coli TG1by electropo-ration.Phagemid-containing bacterial colonies were infected with M13KO7and the ScFv fusion protein was displayed on the surface of recombinant phage.RESULTS Titer of rat serum was1.2×106 after being immunized with OUA-OVA.The VH ，VL fragment was340bp and325bp，respectively.After assembly，the ScFv was about720bp.The library ca-pacity was1.2×108 .Ten clones of twelve clones contained2.1kb fragment after EcoRI and HindⅢdigestion.Trans-fection test indicated that the titer of the culture supernatant was about9×1014 pfu L-1 .CONCLUSION A phage display library of ouabain ScFv antibody has been constructed suc-cessfully.
0 引言
近几年来，抗体已较多地应用于基础研究与临床，但由于mAb的鼠源性而大大限制了其在临床上应用，由此相继出现了基因工程抗体和噬菌体抗体库技术.我们通过噬菌体展示技术制备钠泵抑制物（又称内源性哇巴因，endogenous ouabain，EO）单链抗体库，以期从中筛选到钠泵抑制物单链抗体.
1 材料和方法
1.1 材料 RNA及mRNA提取试剂盒分别为美国Gibco公司及美国Bio101公司产品.逆转录酶为Pharmacia公司产品.Taq DNA聚合酶为美国Promega公司产品;dNTP为Clontech公司产品.PCR引物为Pharmacia公司产品，其中①Heavy-chain primer1和2分别为VH 基因5’端和3’端引物，用来扩增鼠Ig VH 基因;②Light-chain primer mix为10种VL 基因引物的混合物，用来扩增鼠Ig VL 基因;③Linker primer mix:序列为（Gly4 Ser）3 ，该引物两端的各24个碱基分别与VH 和VL 基因的3’端和5’端相互补，从而可将VH 和VL 基因片段拼接成ScFv基因;④RS primer mix为带有SfiI位点的重链基因5’端引物和带有NotI位点的轻链基因3’端引物的混合物，用来扩增ScFv基因片段同时引入克隆位点.噬菌粒载体pCANTAB5E为Pharmacia公司产品.其中含有氨苄抗性基因（Ampr ），Plac启动子及M13噬菌体间隔区片段，用于克隆ScFv基因的SfiI，NotI克隆位点及E tag序列和瑚珀终止码TAG;⑤辅助噬菌体M13KO7为Pharmacia公司产品，带有突变型基因Ⅱ，质粒复制起点和卡那霉素抗性基因（Kanr ），在其辅助下可使前者产生含单链噬菌粒基因组的噬菌体颗粒.细菌菌株TG1 为Pharmacia公司产品，用于ScFv噬菌体表面展示.
1.2 方法［1-5］ 6wk龄雌性BALB/c小鼠（本校实验动物中心提供）体质量17～20g，适应性饲养1wk后，以50μg OUA-OVA（ovalbumin）免疫小鼠，每隔4wk免疫1次，共免疫3次，末次免疫后3d，取免疫效果较好的小鼠立即处死，迅速取出脾脏，分离淋巴细胞，按TRIzol试剂说明书要求提取细胞总RNA，用Bio101试剂盒提取mRNA.参照Pharmacia公司的逆转录系统产品说明书，以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下37℃1h合成cDNA第1条链.以逆转录合成的cDNA第1条链为模板，用通用引物进行全套VH 和VL 基因的扩增.纯化回收的VH ，VL 基因片段与Linker primer mix以相同或接近等摩尔浓度混合进行重叠延伸PCR反应，从而将全套VH ，VL 基因随机拼接成ScFv基因库.以RS primer为引物将拼接的ScFv扩增，同时在5’及3’端分别加上SfiI，NotI酶切位点.用SfiI和NotI消化ScFv，将全套ScFv基因片段与pCANTAB5E载体在T4DNA连接酶（5～7）U作用下进行连接.同时作载体自连和阳性插入（control insert）对照.用Bio Rad电转化仪将连接产物转化入TG1感受态细胞，37℃摇床1h后，取100μL涂于SOBAG（含有100mg L-1 氨苄青霉素和20g L-1 葡萄糖的SOB培养基）琼脂板上，30℃培养24h.从生长良好的SOBAG平皿上挑取12个单菌落提取质粒用EcoRⅠ和HindⅢ进行酶切鉴定.取部分菌液加氨苄青霉素至终浓度为100mg L-1 和葡萄糖至终浓度为20g L-1 ，37℃振 荡培养（250r min-1 ）1h.至对数生长期后，加入M13KO7辅助噬菌体，37℃振荡培养1h.离心，弃上清后将沉淀细胞再悬浮于2×YTAK（含有100mg L-1 氨苄青霉素和50mg L-1 卡那霉素的2×YT培养基）中，37℃振荡培养（250r min-1 ）过夜.离心，收集上清即为含全套ScFv基因的噬菌体表面展示文库.将所得文库做10-6 ，10-8 ，10-10 和10-12 梯度稀释，进行噬斑培养实验，观察噬斑生长情况以判断ScFv基因噬菌体表面展示文库的滴度.
2 结果
2.1 OUA┐OVA的免疫效果 以50μg/次的OUA-OVA免疫BALB/c小鼠，ELISA法测血清中抗体的效价最高可达1 2×106 .
2.2 全套VH ，VL 基因片段的扩增和鉴定 以逆转录合成的cDNA第1条链为模板，加入针对鼠Ig V区基因不同家族的重链和k轻链可变区引物进行PCR，即得到了全套抗体VH 和VL 基因.电泳结果显示，扩增出的VH 基因片段约为350bp，VL约为325bp，VH 略大于VL （Fig1），与预期的片段大小相符.
图1 略
2.3 全套ScFv基因的拼接和PCR扩增 将纯化回收后的VH 和VL 基因片段，经过定量，各取VH 和VL 50ng与Linker-Primer混合.经7次重叠延伸反应，可将VH ，VL 基因片段随机连接成VH -Linker-VL （ScFv）.以此为模板，再以RS prime进行第2次扩增，在VH 基因5’端加上SfiI位点，Jk基因3’端加上NotI位点.电泳结果表明，扩增产物约为720bp（Fig2）.
2.4 全套ScFv基因的克隆和文库的构建 经SfiI和NotI消化后，将纯化的ScFv基因克隆入pCANTAB5E载体中，以全部连接产物电转化TG1 细胞，转化效率最高可达8×1011 μg-1 ，然后在SOBAG选择性固相培养基上筛选转化的菌落.在载体自连对照和无连接产物转化菌的平皿上，均无单菌落生成;而在阳性插入对照和连接产物转化菌平皿上，均见大量单个菌落形成.随机挑选12个单菌落制备噬菌粒DNA，以EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，10个单菌落所提噬菌粒DNA切出了约为2.1kb的条带（含有外源插段），与预测结果一致（Fig3），表明克隆较成功，所构建的噬菌体抗体库库容量约为1.2×108 ，由于经过2次PCR有重复克隆的存在，实际的库容量可能没有这么大.噬菌粒文库经过M13KO7超感染后，产生的重组噬菌粒可释放于细菌培养上清中，经噬斑计数，滴度为9×1014 pfu L-1 .
图2 － 图3 略
3 讨论
内源性钠泵抑制物，即内源性哇巴因（endoge-nous ouabain，EO）是由肾上腺皮质分泌的一种类固醇激素，可能通过抑制钠泵活性，影响Na+- Ca2+ 交换 而致血压升高［6，7］ .多种高血压动物模型及高血压病人体内钠泵抑制物含量均明显增加［6-8］ ，为高血压发生的重要原因之一，成为高血压研究的又一热点.EO升高血压的机制目前尚不完全清楚，EO与高血压间的联系可能是通过改变钠泵构型以及改变钠泵各亚单位在组织中的重分布，从而抑制Na+ ，K+- ATP酶，增加细胞内Na+ ，刺激Ca2+ 摄取和平滑肌反应性，继发性地引起一系列细胞生物学的改变［9-12］ .①抑制Na+ ，K+ -ATP酶，增加Na+ -Ca2+ 交换，细胞内Ca2+ 增多直接引起血压收缩;②钠泵受抑制后中枢交感神经活性增加;③通过抑制钠泵活性而迅速增加神经突触释放神经递质，增加外周交感神经系统活性;④增加阻力血管对内源性血管加压物质敏感性，降低驰张因子作用;⑤通过增加醛固酮水平，进一步促进钠水潴留，提高血管张力;⑥刺激血管平滑肌增生，使周围小血管阻力增加;⑦促进内皮细胞分泌内皮素;⑧使压力反射系统敏感性降低.
利用噬菌体抗体库技术制备抗体是继基因工程抗体后分子生物学领域的又一场革命，外源基因产物通过与噬菌体外壳蛋白融合呈现在噬菌体表面，将抗原固定在包被板上，经过几轮“吸附-洗脱-扩增”，便可得到目的抗体［15-17］ .它的最大优势是不经免疫可以直接从正常人外周血、淋巴结、骨髓构建的噬菌体抗体库中筛选得到人源性抗体［16，18］ .在构建噬菌体抗体库方面有诸多技术尚需要探讨:①得到纯度、完整性好的mRNA是整个实验成功与否的关键，它决定了构建库的质量和效率及下面操作的难易程度;②由重叠延伸PCR将全套VH ，VL 随机拼接成全套ScFv是整个实验中较难的一步.这要求VH ，VL 和linker三者等摩尔混合，VH ，VL 各50ng拼接成功的概率最大;③电转化效率是决定库容量的关键因素.
噬菌体抗体库技术成为制备单克隆抗体的有效手段，已取得了令人鼓舞的成就，预示着其良好的发展前景.
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