作者：梁英民 蒋姗姗 孙强 吴绒丽 陈萍 李荣 周鹏 王键 韩骅
【关键词】 基因表达
关键词: bcr/abl;基因表达;融合蛋白;抗血清
摘 要:目的 克隆并表达bcr/abl融合基因片段，并制备其抗血清. 方法 PCR扩增包含蛋白融合点的bcr/abl癌基因片段，序列测定后克隆入带有His标签的原核表达载体pET-16b，转化宿主菌BL21，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析表达结果，Ni-NTA树脂亲和纯化，皮下多点注射免疫小鼠，ELISA确认抗血清的滴度. 结果 PCR扩增得到大小约523bp的目的片段，序列测定表明与发表序列完全一致;得到了一种新的癌基因bcr/abl片段的原核表达载体pET-16b-bcr/abl，在BL21中表达可见于Mr21×103 处有一蛋白新生带，表达的BCR/ABL蛋白免疫小鼠后，ELESA确认抗血清的滴度&>1∶2000. 结论 成功的克隆、表达了bcr/abl融合基因片段，并制备了相应的抗血清.
Keywords:bcr/abl;gene expression;fusion protein;immune serum
Abstract:AIM To clone and to express bcr/abl fusion gene fragment and to produce immune serum against the expressed fusion protein.METHODS PCR-amplified bcr/abl gene fragment was inserted into plasmid pET-16b with His tag to form a new plasmid pET-16-bcr/abl（pEb）.The BCR/ABL fusion protein was expressed in E.coli BL21trans-formed with pEb and induced with IPTG.The expressed pro-tein was purified by affinity resin-Ni-NTA and analyzed by SDS-PAGE.In order to produce anti-serum，Mice were im-munized by subcutaneously multi-site injection with BCR/ABL protein.The anti-serum was assayed by ELISA.RE┐SULTS Molecular weight of the PCR-aimplified bcr/abl gene fragment which was consistent with the published se-quence was about523bp.Plasmid pEb was constructed.The molecular size of BCR/ABL protein expression was about Mr21×103 .The titer of the BCR/ABL protein anti-serum was more than1∶2000.CONCLUSION Fragment of bcr/abl fu-sion gene is successfully cloned and expressed.The antiserum of BCR/ABL protein fragment has been produced.
0 引言
慢性粒细胞白血病（Chronic myelogenous leukemia，CML）是起源于骨髓造血干细胞的恶性肿瘤.绝大多数CML患者的肿瘤细胞带有染色体异常，即9∶22号染色体易位，形成特征性的费城染色体（Pheladophia，ph染色体）［1，2］ .在分子水平，这一染色体易位造成bcr基因和abl基因的融合，表达的BCR/ABL融合蛋白具有持续性的激酶活性，引起细胞的转化［2］ .Bcr/abl融合蛋白被认为是CML特异性肿瘤抗原，可作为CML诊断和治疗的指标［3-6］ .我们用PCR扩增了BCR/ABL融合蛋白的基因片段，并在大肠杆菌中进行了表达.表达产物经纯化复性后，用于免疫小鼠，得到可识别该抗原的小鼠抗血清.
1 材料和方法
1.1 细菌和质粒 大肠杆菌XL-10gold由本室保存.质粒pET-16b及大肠杆菌BL21均来自Nav-agene公司.带有人bcr/abl（b3a2）融合基因的质粒pGD210由本校附属唐都医院血液科刘立博士提供.
1.2 引物设计与bcr/abl融合基因表达质粒的构建 DNA重组所用试剂来自Promega、宝生物工程公司及华美生物工程公司.以质粒pGD210为模板，用PCR扩增了bcr/abl基因跨越融合点的523bp基因片段（93aa-265aa）.PCR引物的序列为:上游引物:5’-CTCGAGACGTTCCTGATCTCCTCT;下游引物:5’-GGATCCTTAGTAGTTGCTTGGGACC-CA.PCR产物经电泳回收纯化后插入pGEM-T载体（Promega），进行DNA序列分析.从正确克隆的载体中，用Xho I和BamH I双酶切下含有bcr/abl融合基因插入片段，插入质粒pET-16b，得到表达BCR/ABL融合蛋白的质粒pET-bcr/abl（Fig1），以下简称pEb.
1.3 重组蛋白的诱导表达和纯化 用表达质粒pEb转化大肠杆菌BL21，加入IPTG至终浓度1mmol・L-1 ，诱导不同时间后，收集菌体.悬浮于PBS，超声裂菌，离心弃去上清.向沉淀中加入2mol・L-1 尿素，离心除去杂蛋白.再用8mol・L-1 尿素溶解沉淀的蛋白，在Ni-NTA-agarose柱（Vector公司）上进行亲和层析.用250mmol・L
-1 咪唑洗脱.收集洗脱的蛋白，透析后冻干保存.
图1 略
1.4 抗血清的制备 BALB/c小鼠由第四军医大学实验动物中心提供，用50μg基因重组的BCR/ABL融合蛋白与等量的福氏佐剂混后皮下多点注射，每周一次，第四周腹腔注射加强一次，加强免疫后14天取血，分离血清备用.
1.5 酶联免疫试验（ELISA） 向96孔板中加入纯化的BCR/ABL融合蛋白（5μg/μL）100μL，4℃包被过夜.加入稀释的经免疫小鼠的血清与未经免疫小鼠的血清，血清稀释度均为1∶500，1∶1000，1∶2000，1∶4000，1∶8000，1∶16000，设一阴性对照孔， 37℃水浴1h，加入酶标抗体，37℃1h，TMB显色15～30min，酶联免疫检测仪测定，测定波长为492nm.
1.6 DNA序列分析 按说明书用PE公司的荧光DNA序列测定试剂盒（Big-dye）进行序列测定反应，用310型DNA序列测定仪进行电泳及结果分析.
2.1 bcr/abl基因的亚克隆 为表达BCR/ABL融合蛋白融合点两侧约200个氨基酸的片段.以全长bcr/abl基因为模板，用PCR扩增了这一片段的cD-NA.Fig2显示523bp的目的片段被扩增出来.将这一片段插入T载体后，进行DNA序列分析，但在5’和3’端分别插入了设计的Xho I和BamH I酶切位点.
图2 略
2.2 BCR/ABL融合蛋白的诱导表达 用bcr/abl表达质粒pEb转化大肠杆菌BL21，培养后用IPTG进行诱导.SDS-PAGE分析结果表明，与用pET-16b转化的BL21及未转化质粒的BL21裂解产物相比，在21kd处有一新生蛋白带，与预期的融合蛋白分子大小相同.灰度扫描显示IPTG诱导3h后融合蛋白的表达约占细菌总蛋白的20%.
2.3 BCR/ABL融合蛋白的纯化 用Ni-NTA-a-garose亲和层析柱进行BCR/ABL融合蛋白的纯化.收集蛋白峰，PBS透析后，进行SDS-PAGE分析（Fig3）.表达的融合蛋白被纯化为单一条带.
2.4 BCR/ABL融合蛋白在小鼠中的抗体应答 收集免疫小鼠的抗血清，ELISA检测结果见图4，与正常对照比较，接受融合蛋白免疫的小鼠产生了较高滴度的血清，说明基因重组的BCR/ABL融合蛋白对小鼠具有免疫原性.
图3 － 图4 略
3 讨论
bcr/abl融合基因是CML的分子标记，bcr/abl融合基因编码一个分子量为Mr21×104 的融合蛋白.由于融合蛋白连接区的氨基酸序列是其他任何正常蛋白质不具有的，被认为是CML细胞所特有的.BCR/ABL融合蛋白是一种胞浆内蛋白，研究bcr/abl融合蛋白在细胞表面的表达的类型和该融合蛋白的免疫学特点对开展CML的免疫治疗有重要意义［3-6］ .然而，由于融合蛋白很难从患者体内获得，而且在细胞内加工和提呈的效率也难以检测，为此，本文用体外基因重组的方法获得了bcr/abl融合蛋白的原核表达产物，经纯化复性后，用于免疫小鼠，得到了可识别该抗原的小鼠抗血清，为随后的单克隆抗体制备及免疫治疗的研究奠定了基础.
参考文献
［1］Kurzrock R，Gutterman JU，Talpaz M.The molecular genetics of Philadelphia chromosome-positive leukemias ［J］.N Engl J Med，1988;319（15）:990-998.
［2］Shtivelman E，Lifshitz B，Gale RP，Canaani E.Fused transcript of abl and bcr genes in chronic myelogenous leukaemia ［J］.Na-ture，1985;315（6020）:550-554.
［3］Liang Y M，Sun Q，Jiang S S，Cheng P，Wang J S，Liu L，Han H.Expression of PTD-bcr/abl fusion oncoprotein fragment carrying protein transduction domain and its transmembrane transportation ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（7）:Cover2.
［4］Feng Q，Sun BZ，Zhao YT，Sun K，Yan Z，Han W，Zhang YQ.Study on the cleavage ability of three ribozymes specific to the different sites of bcr-abl fusion gene ［J］.Di-si Junyi Dax-ue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（4）:284-287.
［5］Bocchia M，Wentworth PA，Southwood S，Sidney J，McGraw K，Scheinberg DA，Sette A.Specific binding of leukemia onco-gene fusion protein peptides to HLA class I molecules ［J］.Blood，1995;85（10）:2680-2684.
［6］Osman Y，Takahashi M，Zheng Z，Koike T，Toba K，Liu A，Furukawa T，Aoki S，Aizawa Y.Generation of bcr-abl specific cytotoxic T-lymphocytes by using dendritic cells pulsed with bcr-abl（b3a2）peptide:its applicability for donor leukocyte transfusions in marrow grafted CML patients ［J］.Leukemia，1999;13（2）:166-174.