【关键词】 染料木黄酮
关键词: 染料木黄酮;CyclinD1基因;CDK4蛋白;bcr-abl融合基因
摘 要:目的 研究Genistein抑制K562细胞生长的机制及对CyclinD1基因和bcr-abl融合基因表达的影响. 方法 用RT-PCR方法检测Genistein作用于K562细胞前后CyclinD1基因和bcr-abl融合基因的mRNA表达变化，用免疫荧光、流式细胞仪和电镜检测CDK4蛋白的表达、细胞周期及凋亡. 结果 K562细胞中CyclinD1基因、bcr-abl融合基因的mR-NA和CDK4蛋白表达阳性，用Genistein与K562细胞共同孵育后，bcr-abl融合基因的mRNA表达阴性，CyclinD1的mRNA和CDK4蛋白表达下降，细胞阻滞于G2/M期，K562细胞出现凋亡. 结论 bcr-abl融合基因、CyclinD1基因和CDK4蛋白在K562细胞中高表达，Genistein能使K562细胞生长受抑，诱导其凋亡，抑制bcr-abl基因的mRNA表达，并使CyclinD1基因的mRNA和CDK4蛋白表达下降，表明bcr-abl融合基因、CyclinD1基因和CDK4对慢粒发展存在内在关系.
Keywords:Genistein;CyclinD1gene;CDK4protein;bcr-abl fusion gene
Abstract:AIM To investigate the mechanism of how Genis-tein restrains the growth of K562cells，and its effect on the expression of CyclinD1gene and bcr-abl fusion gene.METHODS Genistein was incubated with K562cells，the mRNA of CyclinD1gene and bcr-abl fusion gene were exam-ined by RT-PCR and the expression of CDK4protein，cell cy-cle and apoptosis were examined by immunofluorescence，flow cytometry and electron-microscope at the same time.RESULTS The expression of CyclinD1gene and bcr-abl fu-sion gene’mRNA was positive in K562cells.After K562cells was incubated with Genistein，the expression of bcr-abl fusion gene’mRNA and CDK4protein were negative，mRNA of CyclinD1gene decreased.And the cell was blocked in G2/M phase.Using electron-microscope we could observe the cell’s apoptosis.CONCLUSION CyclinD1gene and bcr-abl fusion gene are highly expressed in K562cells.The growth of K562cells could be restrained by using Genistein，which induces K562cell’s apoptosis，repress the expression of bcr-abl fusion gene，and makes CyclinD1and CDK4protein de-crease.This illuminates that CyclinD1gene，CDK4protein and bcr-abl fusion gene may have relation to the pathogenesis of chronic myelogenous leukemia（CML）.
0 引言
肿瘤的发生、发展与细胞周期调控失调密切相关，细胞周期有关的原癌基因（如CyclinD1）与细胞增殖相关的癌基因（如bcr-abl）在肿瘤发展上存在密切关系.已有文献［1，2］ 报道，用RT-PCR方法检测到K562细胞中CyclinD1基因和bcr-abl融合基因的mRNA高表达，我们进一步用酪氨酸激酶抑制剂Genistein作用于K562细胞后，观察CyclinD1基因、bcr-abl融合基因的mRNA和CDK4蛋白表达的变化，同时观察Genistein对K562细胞生长、周期变化及凋亡的影响，探讨其抑制K562细胞生长的机制.
1 材料和方法
1.1 材料 K562细胞株由西京医院血液科于文强博士惠赠.Genistein购于美国Sigma化学制剂公司，CDK4单抗购于美国Santa Cruz化学制剂公司（由博士德公司提供），扩增CyclinD1基因和bcr-abl融合基因的引物由大连宝生物Takara公司合成.
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 K562细胞用含100mL・L-1 胎牛血清的RPMI1640培养液置37℃，50mL・L-1 CO2 孵箱中培养，实验取对数生长期细胞.绘制细胞生长曲线，每隔24h台盼蓝染色，计算细胞存活率.
1.2.2 RT-PCR检测CyclinD1基因和bcr-abl融合基因的mRNA表达 将对数生长期细胞接种于6孔培养板中，细胞密度为3×109 ・L-1 ，加入40mg・L-1 的Genistein，置37℃，50mL・L-1 CO2 孵箱中培养48h后，采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿法抽提总RNA，反转录成cDNA后进行PCR扩增.扩增Cy-clinD1基因的引物顺序:上游引物5′-CTGGCCAT-GAACTACCTGGA-3′，下游引物5′-GTCACACT-TGATCACTCTGG-3′，扩增483个bp［1］ ;扩增bcr-abl基因引物序列:上游引物5′-GATGCTGAC-CAACTCGTGTG-3′，下游引物5′-ACACCATTCC-CCATTGTGAT-3′，扩增376个bp［3］ ，10g・L-1 琼脂糖电泳检测扩增产物.
1.2.3 检测细胞周期、凋亡及CDK4单抗 用流式细胞仪检测，取2×106 个细胞，700mL・L-1 乙醇（-20℃预冷）固定24h，离心，弃去乙醇，细胞重悬浮于PBS液中离心洗涤2次，去上清，细胞重悬浮于DNA染液中（含碘化丙锭），室温避光染色30min，取波长488nm蓝色激发光检测［4］ .参照文献［5］检测CDK4单抗.电镜观察K562细胞凋亡形态.
2 结果
2.1 Genistein抑制K562细胞株生长 Genistein浓度40mg・L-1 时即可明显抑制K562细胞的生长，50.0%细胞生长被抑制时间约48h，作用72h内台盼蓝染色未见死细胞，细胞生长曲线如Fig1.
2.2 CyclinD1基因和bcr┐abl融合基因的mRNA表达降低 K562细胞中CyclinD1基因和bcr-abl融合基因的mRNA表达均为阳性.Genistein作用48h后，bcr-abl融合基因的mRNA表达阴性，CyclinD1基因mRNA表达降低，电泳检测扩增产物，荧光亮度轻度减弱（Fig2，3）.
2.3 Genistein阻断细胞生长于G2/M期及诱导K562细胞凋亡 流式细胞仪检测K562细胞S期细胞占47.7%，提示其DNA的合成、复制活跃，细胞增殖旺盛（Fig4）;Genistein与K562细胞共同作用后， 阻断K562细胞生长主要在G2/M期，使G2/M期细胞数大量增加，S期细胞明显减少（19.5%），并在细胞周期图中的二倍体峰前可见一亚二倍体峰-凋亡峰（apoptosis peak），提示其能抑制K562细胞生长，诱导其凋亡（Fig5）.
图1 图3 略
2.4 CDK4蛋白的表达下降 K562细胞中CDK4蛋白表达阳性（平均荧光强度2.10），Genistein作用24h后，CDK4蛋白的表达水平明显下降（平均荧光强度0.807，Fig6，7）.
图4 －图7 略
2.5 电镜观察到K562细胞凋亡 Genistein作用24h后，K562细胞变小，胞质轻度变性肿胀，核浓缩深染，核膜清楚，染色质聚集成团块状，靠近核膜边缘（Fig8）.并可见早期凋亡小体，核碎裂呈团块状散布于胞质，被细胞膜所包绕，其中无各种细胞器. 3 讨论
K562细胞为慢性粒细胞白血病（慢粒）急变细胞株，含有Ph染色体，产生bcr-abl融合基因，编码p210Bcr-Abl 蛋白，具有异常的高酪氨酸激酶活性，使细胞恶性增殖［6］ .近来研究发现慢粒发病和凋亡受抑［7］ 以及细胞周期调控失调［8］ 有密切联系，Genis-tein治疗慢粒的机制主要是阻断信号传导途径，促进细胞凋亡.其是否在基因水平及细胞周期调控角度发挥抗肿瘤作用，值得进一步研究.
Carler等［9］ 研究发现Genistein能诱导慢粒患者骨髓中Bcr/Abl阳性集落进入凋亡，我们用Genis-tein作用于K562细胞后，出现细胞凋亡和G2/M期阻滞，说明Genistein除能抑制p210蛋白的酪氨酸激酶活性外，尚能从促进凋亡和调控细胞周期角度抑制K562细胞的生长.其诱导K562细胞凋亡的机制，主要是阻断了与bcr-abl相关的信号传导途径（如Ras途径）后，抑制抗凋亡基因bcl-2的表达，并促使凋亡基因fas等发挥作用［10］ .此外，细胞周期的改变，亦是促进细胞凋亡的因素，因G2/M期细胞明显增加，变异基因bcr-abl被阻滞于G2/M期检测点，不能进入M期进行有丝分裂，使其在退出细胞周期过程中逐渐发生凋亡.
图8 略
我们发现，Genistein能抑制bcr-abl融合基因的mRNA表达.Carmelo等［2］ 的研究已排除Genistein通过抑制bcr-abl的转录起作用的机制，故可能是抑制了bcr-abl基因的复制.从细胞周期角度分析，Genistein作用K562细胞后使S期细胞数量明显减少，导致DNA的合成、复制减少，变异基因bcr-abl的合成和复制相应减少，故bcr-abl融合基因的表达降低.同时发现Genistein能使cyclinD1基因的mR-NA表达下降.Cortez等［11］ 研究bcr-abl融合基因的高酪氨酸激酶活性，可使造血细胞在失去生长因子的条件下激活CDK蛋白.本实验用Genistein抑制了K562细胞中的高酪氨酸激酶活性后，流式细胞仪检测证实能抑制CDK4蛋白的表达，而CyclinD1的表达依赖于CDK4蛋白的活化，因而CyclinD1基因的表达水平下降.在K562细胞中同时有CyclinD1基因和bcr-abl融合基因的高表达，表明CyclinD1基因和bcr-abl基因对慢粒发展可能有密切的联系.Cy-clinD1的过表达使细胞周期中G1/S期检测点功能低下，变异的bcr-abl癌基因失去调控而进入S期复制，不能启动凋亡途径而凋亡，还能使细胞周期及癌基因的复制加速，故CyclinD1基因对bcr-abl融合基因的表达起促进作用.但原癌基因CyclinD1单独作用不能使细胞发生恶性转化［12］ ，必须通过癌基因 bcr-abl而发挥作用.
参考文献
［1］Uchimaru K，Taniguchi T，Yoshikawa M，Asano S，Arnold A，Fujita T，Motokura T.Detection of CyclinD1（bcl-1，PRAD1）over-expression by a simple competitive reverse transcription-polymerase chain reaction assay in t（11，14）（q13，q32）-bearing B-cell malignancies and/or Mantle cell lymphoma ［J］.Blood，1997;89（3）:965-974.
［2］Carmelo CS，Gianpietro D，Lina M，Ester R，Daniela G，Anto-nio B，Camillo A，Gabriella S，Barbara S，Maria TR，Vittorio R.Selection of myeloid progenitors lacking BCR-ABL mRNA in chronic myelogenous leukemia patients after in vitro treatment with the tyrosine kinase inhibitor Genistein ［J］.Blood，1996;88（89）:3091-3100.
［3］Feng Q，Sun BZ，Zhao YT，Sun K，Yan Z，Han W，Zhang YQ.Study on the cleavage ability of three rihozymes specific to the different sites of bcr-abl fusion gene ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（4）:284-287.
［4］Cao RX，Liu ZG，Qu P，Zhang YF.A rapid way of determining activity of cells by flow cytometry ［J］.Di-si Junyi Daxue Xue-bao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（7）:S198.
［5］Cao YX，Liu ZG，Zhong XN，Dong JY.Indirect staining of pe-ripheral blood samples for flow cytometry ［J］.Di-si Junyi Dax-ue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（2）:244-246.
［6］Feng Q，Sun BZ，Zhao YT，Sun K，Yan Z，Han W，Zhang YQ.Construction and identification of a chronic myeloid leukemia specific bcr-abl3-units ribozyme ［J］.Di-si Junyi Dax-ue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1998;19（4）:471-472.
［7］Shang ZC，Sun BZ，Feng Q，Wang CH，Xie XP，Song TT，Zhu HF.The synergistic effects of bcr-abl and c-myc anti-sense oligodeoxynucleotides on chronic myeloid leukemia ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（3）:275-277.
［8］Bedi A，Barber JP，Bedi GC，Deney WS，Sidransky D，Vala MS，Akhtar AJ，Hilton J，Jones RJ.Bcr-Abl mediated inhibi-tion of apoptosis with delay of G2/M transition after DNA dam-age:A mechanism of resistance to multiple anticancer agents ［J］.Blood，1995;86（1）:1148-1158.
［9］Carler SC，Dotti G，Mangoni L，Regazzi E，Garau D，Bonati A，Almici C，Sammarelli G，Savoldo B，Rizzo MT，Rizzoli V.Selection of myeloid progenitors lacking bcr-abl mRNA in chron-ic myelogenous leukemia patients after in vitro treatment with the tyrosine kinase inhibitor Genistein ［J］.Blood，1996;88（8）:3091-3100.
［10］Raitano Whang YE，Sawyers CI.Signal transduction by wild-type and leukemogenic abl proteins ［J］.Biochim Biophys Acta，1997;1333（3）:F201-F216.
［11］Cortez D，Reuther G，Pendergast AM.The bcr-abl tyrosine ki-nase activate mitogeniz signaling pathways and stimulates G1-to-S phase transition in hematopoietic cells ［J］.Oncogene，1997;15（19）:2333-2342.
［12］Gao P，Wang MQ.CyclinD and cancer change of cell ［J］.Guowai Yixue-Zhongliuxue Fence（Foreign Med Sci-Cancer Section），1998;25（2）:72-75.