作者：李承新 刘玉峰 王刚 李春英 万业宏
【关键词】 角蛋白
关键词: 角蛋白;人源性抗体;Fab;制备;鉴定
摘 要:目的 用基因工程技术制备人源性抗角蛋白抗体Fab片段，并对其纯度、抗原结合活性及特异性等进行鉴定. 方法 将从半合成噬菌体抗体库中成功地筛选到的特异表达抗角蛋白Fab片段的阳性克隆转化大肠杆菌，IPTG诱导表达，产物经金属鏊合层析纯化，并用ELISA鉴定抗原结合活性和特异性、SDS-PAGE鉴定纯度和蛋白印迹检测抗角蛋白抗体Fab片段识别的抗原组分. 结果 可溶性表达的抗角蛋白抗体Fab片段经金属鏊合层析可有效地纯化，蛋白印迹明确纯化产物为人Fab片段.所纯化的Fab片段在非还原SDS-PAGE中形成Mr 50×103 单一条带，在还原SDS-PAGE中可见Mr 23×103 ，Mr 25×103 两条带.ELISA和Western blot证实该片段具备良好的抗原结合活性和抗原特异性. 结论 成功表达并鉴定了人源性抗Mr 48×103 角蛋白的Fab可溶性片段，为人源性抗角蛋白抗体工程化、进一步研究该抗体的生物活性并提高其临床应用价值奠定了良好的基础.
Keywords:keratin;human antibody;Fab;preparation;i-dentification
Abstract:AIM To express human Fab fragment against Mr 48×103 keratin in E.coli，and identify its purity，combining activities with antigens and antigenic specificity.METHODS The specific anti-48kd keratin clone was selected from the established semisynthetic phage antibody library and trans-formed into E.coli xL1-blue.The specific Fab fragments were expressed by using IPTG as inducing agent.After being purified by immobilized metal ion affinity chromatography（IMAC），the expressed products were verified by ELISA，SDS-PAGE and Western blot.RESULTS Soluble anti-ker-atin-Fab fragment could be efficiently purified by IMAC，and the purified products were identified to be human Fab frag-ment by Western blot.The purified Fab fragment formed a single band under non-reducing conditions and two bands un-der reducing conditions in SDS-PAGE.The purified Fab fragment possessed good antigenic specificity as well as the excellent combining activities with antigens as verified by ELISA and Western blot.CONCLUSION The high level expression and identification of soluble human anti-keratin-Fab fragment may lay a potentially good foundation of engi-neering human anti-keratin Fab，of further researching its bi-ological activities and of facilitating its potential clinical appli-cation.
0 引言
1989年以来，直接利用噬菌体显示技术（phage display technology）筛选和制备目标抗体获得成功.该技术不经杂交瘤途径，就可以制备和生产单克隆抗体.因此，被誉为单克隆抗体制备技术上的革命性进展［1］ .我们曾利用该技术自半合成噬菌体抗体库中成功地筛选到人源性抗角蛋白抗体［2］ ，为准确、深入地了解AK auto Ab的功能和阐明抗角蛋白抗体临床应用的前景，我们将筛选到的特异表达抗角蛋白Fab片段的阳性克隆，在大肠杆菌XL1-blue中成功表达，并用金属螯合层析法进行了纯化.产物经鉴定具备良好抗原特异性和抗原结合活性.
1 材料和方法
1.1 材料 从噬菌体抗体库中筛选出的人源性抗Mr 48×103 角蛋白的Fab阳性克隆RRKZ由海军总医院中心实验科王刚提供.该抗Mr 48×103 角蛋白的Fab阳性质粒含有抗角蛋白抗体的全部轻链基因（CL+JL+VL）及木瓜酶酶切位点以上部分的重链基因（CH1+JHD+VH），两部分基因克隆于可溶性Fab表达载体p3MH.该载体系在pCOMB3H的基础上于基因Ⅲ3’端加了6个组氨酸编码序列，以利于表达产物的纯化.表达产物为人源性抗角蛋白的Fab片段.诱导剂:异丙基-β-D半乳糖苷（IPTG）（Promega）.人表皮角蛋白抗原和IgG型AK auto Ab由本室制备.HRP-羊抗人IgG Fab抗体及镍离子螯合层析柱分别为Sigma公司和Pierce公司产品.
1.2 方法
1.2.1 人源性抗角蛋白Fab片段的原核表达 将阳性克隆RRKZ的质粒转化大肠杆菌XL1-blue，挑取单集落在1.5mL2YT培养液中振荡培养至A600nm ≈0.6，然后按1∶100扩大培养，3h后加IPTG至终浓度为1mmol・L-1 ，37℃诱导过夜.次日收集菌液离心，上清中即含有可溶性Fab抗体.
1.2.2 人源性抗角蛋白Fab片段的纯化 人源性抗角蛋白Fab片段的纯化步骤基本按试剂盒说明进行.方法是:人源性抗角蛋白Fab片段原核表达上清先用50%饱和度硫酸铵盐析沉淀，pH6.8平衡缓冲液透析后上柱，分别用洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2洗脱非特异结合的蛋白，再用洗脱缓冲液解离特异的Fab片段，收集解离液，透析后经BCA蛋白检测试剂盒定量备用.
1.2.3 人源性抗角蛋白Fab片段的纯度与结合活性 纯化产物经100g・L-1 SDS-PAGE鉴定纯度，并用纯化抗体与角蛋白以及无关抗原HBsAg、结蛋白、铁蛋白、胃蛋白酶等的ELISA反应判断其结合活性和特异性.各种抗原均以碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释至1.25mg・L-1 包被酶联板4℃过夜，经10g・L-1 BSA封闭后滴加1∶10和1∶100稀释的纯化抗体洗脱液37℃孵育1h，PBS（Tween-20）洗涤，加1∶2000HRP-羊抗人IgG Fab37℃孵育1h，再次洗涤后OPD显色测定A490nm 值.
1.2.4 蛋白印迹检测 用于检测Fab的表达情况以及鉴定人源性抗角蛋白Fab结合角蛋白的组分.①将纯化样品在100g・L-1 胶浓度下进行SDS-PAGE电泳，并电转移至硝酸纤维素膜上，以50g・L-1 脱脂奶粉-PBS4℃封闭过夜，用辣根过氧化物酶标记的抗人IgG Fab抗体结合，孵育、洗涤，DAB显 色;②将角蛋白抗原在100g・L-1 胶浓度下进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后取下凝胶，转移至硝酸纤维素膜，以50g・L-1 脱脂奶粉-PBS4℃封闭过夜，滴加纯化的人源性抗角蛋白Fab，室温摇床孵育2h，洗涤，加用辣根过氧化物酶标记的抗人IgG Fab抗体再次孵育，洗涤，DAB显色.
2 结果
2.1 人源性抗角蛋白Fab表达与纯化 用BCA蛋白定量检测试剂盒及ELISA定量估算，培养上清中可溶性Fab段表达的含量为120μg・L-1 .表达上清经50%饱和硫酸铵沉淀后，溶于PBS对平衡液充分透析后上柱，用50倍柱床体积的洗涤缓冲液充分洗涤后，用洗脱缓冲液解离，解离体积与蛋白浓度的相关曲线形成一锐利的单峰.收集解离液，经BCA蛋白检测试剂盒定量，计算回收率为47.2%.
2.2 可溶性抗角蛋白Fab纯度鉴定 为鉴定经金属螯合层析所纯化的Fab段的纯度，将样品浓缩后进行SDS-PAGE（Fig1）.可以看出，在还原条件下，可以看到Mr 25×103 的Fd段和Mr 23×103 的κ链.在非还原条件下进行SDS-PAGE，可见到Mr 50×103 的Fd与κ链的双聚体.进一步证实纯化组分中95.0%以上为Fab段蛋白.
图1 略
2.3 可溶性抗角蛋白Fab片段的抗原结合活性 从用1∶100稀释的抗角蛋白Fab与各种抗原反应的测定结果（Fig2）中可以看出，抗角蛋白Fab片段与角蛋白具有良好的结合活性，而与HBsAg、结蛋白、胃蛋白酶和铁蛋白等无关抗原不结合，说明抗角蛋白Fab片段的特异性良好.
图2 抗角蛋白Fab与各种抗原的结合活性 略
2.4 蛋白印迹检测结果 Fig3为蛋白印迹检测结果.将Fab片段先进行SDS-PAGE后转膜，再用辣根过氧化物酶标记的抗人IgG Fab抗体进一步显色，表明表达、纯化的产物为人源性IgG抗体的Fab片段（F）.标准角蛋白抗原经电泳并转印到硝酸纤维素膜以后，用我们制备的抗角蛋白Fab片段进行染色，约在Mr 48×103 处出现着色条带，其他部位和阴性对照无着色（K），说明该抗体特异性地识别Mr 48×103 的角蛋白，与其他分子质量的角蛋白无交叉反应.
3 讨论
人体内广泛存在的天然自身抗体对维持机体内环境的自身稳定起着重要的作用［3，4］ .天然抗角蛋白自身抗体不仅是机体免疫调节网络的重要组成部分，而且，在一些病理情况下有可能影响疾病的发展过程，有潜在的临床应用价值［5，6］ .因此，积极探讨和研究抗角蛋白自身抗体临床应用的可能及其作用机制具有重要意义.我们曾经尝试用不同滴度AK au-toAb的动物模型［7］ 或应用免疫球蛋白来研究天然抗角蛋白自身抗体对皮肤疾病［8-10］ 的影响，但影响因素非常多.通过角蛋白亲和层析柱［11］ 自正常人血清中纯化AK autoAb
［12］ ，并用其来观察该抗体对培养角质形成细胞［13］ 或某些皮肤病的影响［14］ ，虽然在一定程度上阐明了AK autoAb的作用及机制，但是，由于提取的抗角蛋白抗体是针对多种表皮角蛋白的多克隆抗体，使用自正常人血清中纯化的AK autoAb作为研究手段尚无法明确针对某一特定分子质量角蛋白的作用，而且，血液制品临床应用的安全性问题愈发引人关注.因此，要想准确、深入地了解AK au-toAb的产生机制及功能，加快AK autoAb临床应用的进程，设法制备人源性单克隆抗角蛋白抗体是十分必要的.
噬菌体抗体库技术为人源性单抗的制备提供了简便、有效的途径.我们利用该技术从半合成噬菌体抗体库中克隆了人源性抗角蛋白抗体［2］ ，并成功地得到了可溶性表达的Fab段.有效纯化所表达的抗体分子片段才能得到有实用价值的抗体制品，故纯化方法十分重要.从表达上清中纯化抗体分子片段通常采用亲和层析或离子交换层析的方法，但后者选择性差.由于我们在构建克隆表达载体时插入了聚组氨酸尾巴［15］ ，因此，可以利用聚组氨酸与金属镍离子发生螯合并通过改变pH值而解离的特点将抗体蛋白从大肠杆菌表达上清中纯化出来.一般用的层析洗脱条件是强酸或高盐，容易损伤抗体的空间结构，损害抗原结合能力.我们使用商品化的中性洗脱溶液能有效保护抗体的活性.纯化的样品经ELISA检测表明具有与角蛋白结合的能力.
通过SDS-PAGE电泳和免疫印迹证明了纯化产物为人源性Fab片段，但是，Fab片段的抗原结合活性和特异性是反映所获抗体生物学活性的最主要指标.纯化的样品经ELISA和Western blot检测证明不仅具有良好的抗原结合活性，而且，具有相当高的特异性，仅识别Mr 48×103 的角蛋白，与其他抗原或其他分子质量的角蛋白无交叉反应.Mr 48×103 的角蛋白相当于K16，是银屑病等表皮过度增殖性疾病的标记蛋白，并不存在于正常表皮角质形成细胞内［16，17］ .我们发现，针对Mr 48×103 角蛋白的鼠源性单抗5G5能够抑制表皮角质形成细胞的增殖，提示本实验所获得的具有良好结合活性和特异性的Fab基因工程抗体有可能通过识别Mr 48×103 角蛋白分子而发挥类似鼠源性单抗的抑制效应.我们的工作使最终生产有活性的工程化人源性抗角蛋白基因工程产品成为可能，为研究该抗体的生物学活性奠定了基础，同时也为在此基础上进一步改建该抗体、提高其临床应用价值提供了前提.
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