关键词: 眼损伤;视神经;睫状神经营养因子;雪旺细胞神经营养活性物质;大鼠
摘 要:目的 观察睫状神经生长因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）和雪旺细胞神经营养活性物质（Schwann cells neurotrophic agent，SCNA）对视神经损伤后轴突的形态和纤维数目变化的作用. 方法 采用镊夹法制作大鼠视神经损伤模型，损伤后立即一次性向玻璃体内注射CNTF（50ng）或SCNA（10μL），在损伤后1，2，3和4wk时观察夹伤视神经的形态，及进行图像分析和轴突纤维计数. 结果 损伤后视神经轴突减少，间质增多.CNTF组和SCNA组的轴突数密度在1wk时分别为正常值（0.1065±0.0056个・μm-2 ）的0.59和0.61，而对照组为0.55，实验组与对照组比较差异显著（P&<0.05）.但在夹伤2wk后3个组间、各时间点间数据差异均不显著（P&>0.05）. 结论 CNTF及SCNA一次玻璃体给药能在1wk内减缓视神经损伤后轴突数目的减少.
Keywords:eye injury;optic nerve;ciliary neurotrophic fac-tor;Schwann cells neurotrophic agent;rat
Abstract:AIM To study the effects of ciliary neurotrophic factor（CNTF）and Schwann cell neurotrophic agent（SCNA）on changes of configuration and the number of nerve fibers in a rat’s model of the crushed optic nerve.METHODS The optic nerve injury model of rats was induced by crushed at the optic nerve1mm retrobulbarlly.Then an intravitreal injec-tion of CNTF（50ng）or SCNA（10μL）was performed.The cross-section morphology changes were observed1，2，3and4weeks after injury，and the number of nerve fibers was de-termined by using a computerized image analysis system at the time points.RESULTS The axon number of crushed op-tic nerve decreased but the matrix increased.The axon num-ber density of the CNTF group and the SCNA group was0.59and0.61of the normal level（0.1065±0.0056）one week after injury，while the control group’s was0.55（P&<0.05）.But there was no difference in three groups2，3and4weeks after injury.CONCLUSION An intravitreal injection of CNTF or SCNA can reduce the loss of optic nerve fibers in crushed optic nerve，so far only noted within one week after injury.
0 引言
19世纪末至20世纪初，科学家们发现低等脊椎动物如鱼类和两栖类的中枢和外周神经系统（PNS）损伤后都能再生.然而在哺乳动物中，只有外周神经系统损伤后可以再生，而在中枢神经系统（CNS）则不能［1］ .直到80年代初So等［2］ 发现体外中枢神经可以再生，体内神经细胞的轴突不能再生的原因可能为环境因素和抑制因素所致，从此该领域的研究取得一些突破性成果，特别是近十年来的研究工作使人确信，提供适当条件后CNS也是能够再生的.神经再生不仅是神经科学研究的一项重要课题，也是临床医学期待解决的问题之一.视神经损伤是临床上常见的眼外伤，往往引起视力丧失［3］ .由于视神经属于中枢神经系统，损伤后缺乏神经修复和再生所需的微环境和物质，因此视神经损伤后的治疗和功能恢复是临床上的一个难题［4］ .睫状神经营养因子（CNTF）能够促进多种神经细胞的存活，在神经系统发育、分化和损伤修复中具有非常重要的作用［5，6］ ;雪旺细胞是周围神经系统的髓鞘形成细胞，它能分泌数种神经营养因子、细胞外基质、细胞粘附分子等，在周围神经系统成功再生过程中起关键作用［6，7］ .雪旺细胞源性神经营养活性物质（SCNA）是体外无血清培养乳鼠雪旺细胞3～5d时的培养液上清的超滤产物［5，7］ .我们采用大鼠视神经夹伤模型［8］ ，观察夹伤后视神经横断面的形态学变化和视神经轴突纤维数［9，10］ 的变化规律，初步评估CNTF和SCNA对大鼠视神经损伤后修复的作用.
1 材料和方法
1.1 材料 二级成年SD大鼠，2～3mo龄，雌雄不限，体质量200～250g，由本校实验动物中心提供.自由饮食，在光/暗周期为12h/12h（光照时间6:00～18:00）、背景噪音（40±10）db，温度（20±3）℃条件限制下饲养.研究者已获得实验动物使用许可证.实验动物及实验使用条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》.将实验动物随机分为对照组、CNTF组和SCNA组3组，各组又分为7，14，21和28d等4组，每组5只动物.小号动脉阻血镊（上海医疗器械厂，前端1mm宽），CNTF（Sigma公司，美国），体外无血清培养乳鼠的SCNA（西京医院眼科黄蔚博士馈赠）.
1.2 方法 ①视神经夹伤模型制作和玻璃体给药:大鼠im846麻醉剂（1mL・kg-1 ）后置于手术盘中，消毒手术眼局部，于双目显微镜下切开外眦，打开Tenon囊，分离外直肌并剪断，沿颞侧巩膜表面钝性分离至视神经，于眼球后2～3mm处用小号动脉阻血镊夹压视神经15s.治疗组用微量注射器先作前房穿刺，放出约10～15μL房水，然后自角巩膜缘后方0.5～1mm处穿刺入玻璃体，注入CNTF50ng或体外无血清培养乳鼠的SCNA（西京医院眼科黄蔚博士馈赠）10μL［5，11］ ，微量注射器注射头外径0.05mm.将眼球复位，缝合Tenon囊及外眦，于直接检眼镜下观察视网膜血供良好者纳入试验.②动物灌注固定及取材:分别在夹伤后1，2，3和4wk时，经ip戊巴比妥钠（100mg・kg-1 ）深麻醉实验动物，开胸，经左心室插管至升主动脉做灌注固定.先用100mL生理盐水冲净血液，再灌注500mL含40g・L-1 多聚甲醛（Sigma公司，美国）的0.1mol・L-1 磷酸缓冲液（PBS，pH7.3），持续1.5～2.0h.于动物头顶正中切开暴露脑组织并将其完整去除，显露视交叉及视神经，沿视神经走行分离至球后，紧贴眼球将8～10mm长短的视神经完整取下，去除视神经周围筋膜及脂肪组织，置于40g・L-1 多聚甲醛中后固定24h，置于30g・L-1 戊二醛磷酸盐缓冲液中4℃冰箱保 存.③标本超薄切片及甲苯胺蓝染色:保存的标本用100mL蔗糖缓冲液（0.18mol・L-1 ）冲洗，10g・L-1 四氧化锇磷酸盐缓冲液再次后固定，梯度丙酮溶液依次脱水，1kg・L-1 丙酮/混合包埋剂（1∶1）浸透，Epon812包埋.在损伤区远端2mm处用LKB-NOVO型超薄切片机切取1μm半薄横截切片，10g・L-1 甲苯胺蓝染色，自来水冲洗，照相，保存.切片自然晾干，香柏油封片保存.④计算机图像分析:A.神经横截面分析视场选取方法 在100倍镜下作视神经横截面的十字形分割线，然后在200倍镜下以纵向定位线中点为中心由上向下连续选取3个方形视场，每个视场面积为12271.45μm2 （图像分析仪固定数值）.B.神经轴突计数 使用北航病理图像分析系统进行视神经轴突计数［10］ .首先作图像分割，将神经纤维与间质分割开来，分割好图像后定制将要选取的图像中神经纤维点平均积分光密度值（DPI）的最大值和最小值，最大值为2000，最小值为100.计算机自动图像分析系统自动校正放大率，所测数值均为实际值.C.神经纤维数密度的计算 将图像分析仪已数好的神经纤维数文件导入软件Microsoft Excel（Microsoft公司，美国），每组数据均选取DPI值在0.20～1.50范围内的神经纤维点，以保证各样本的统一.此点数除以视场面积即为神经纤维密度，单位:个・μm-2 .
统计学处理:全部数据应用Micro cal Origin5.0软件包进行处理，对实验数据求均数及标准差，健眼作为正常对照.CNTF组、SCNA组和对照组各组各时间点的数据之间分别进行配对t检验和单因素方差分析.
2 结果
2.1 视神经夹伤后形态学的变化 视神经夹伤后，从横断面上观察到神经纤维组织疏松，排列紊乱;神经髓鞘大量脱失，染色深浅不均;间质增多;1wk时轴突广泛水肿;继续观察可见水肿消失，轴突纤维数大量减少，并出现许多空泡状结构（Fig1）.
2.2 视神经夹伤后神经纤维密度的变化 正常值为（0.1065±0.0056）个・μm-2 ，各组神经纤维密度在夹伤后1～3wk内均有大幅度的下降（Tab1）.
3 讨论
视神经损伤后影响神经细胞变性、坏死和修复的因素较多，通过本实验，意在证明视神经损伤后能够减轻神经纤维坏死的因素.临床视神经损伤分为非横断性损伤和横断损伤，非横断伤有一定的修复再生基础［12］ .本实验采用视神经夹伤模型，致伤部位选择在视神经球后段，致伤程度基本定量.视神经夹伤时间15s，时间太短不足以创造可明确观察的损伤，时间太长容易将视神经夹断. 视神经纤维准确计数是观察视神经损伤、修复和再生的一个量化程度很高的方法［5，13］ .Sanchez等［9，10］ 通过视神经横断面神经髓鞘甲苯胺蓝染色，清楚地数清了猴和人视神经的神经纤维数.正常大鼠视神经纤维数约为106 ～1.2×107［14］ .传统的石蜡切片和冰冻切片均太厚，视神经横断面上不能准确数清大鼠全部视神经纤维.本研究通过对大鼠视神经组织进行电镜方法的固定、包埋、作横断面的1μm超薄切片和视神经纤维髓鞘的特异染色，利用计算机自动图像分析系统，对正常大鼠视神经内一定大小直径的神经纤维数和夹伤后大鼠视神经内相应直径的神经纤维数的变化规律进行了观察和分析.在本视神经夹伤模型［4，11］ 中观察到球后视神经夹伤引起的神经纤维减少主要发生在夹伤后3wk内，此期间视神经纤维数下降了70%左右，4wk视神经纤维数仅下降了1.3%.
图1 略
表1 视神经夹伤后神经纤维密度的变化 略
为了使神经营养因子与其受体直接结合，需将CNTF，SCNA等神经营养物质注射到玻璃体内［5］ .虽然重复玻璃体内注射可能会增加RGC的存活，但同时也增加了并发白内障和视网膜缺血的危险性.因此，在视神经损伤后我们采用了玻璃体内一次性注射神经营养物质的方法［5］ .CNTF作为神经营养因子的一种，在神经活动中起着重要作用［15］ .CNTF在进化上是高度保守的，不同种属之间有较大的同源性，人和大鼠、兔子的同源性达85%以上［6］ .Mey等［5］ 在大鼠视神经横断模型实验中结合他人研究反复实验，得出体内应用的CNTF的有效剂量为50ng.本实验在视神经夹伤后将50ng（10μL）重组人CNTF注入玻璃体内，观察到实验组神经纤维数的下降慢于对照组，在损伤早期尤为明显，说明重组人CNTF对于成年SD大鼠视神经损伤后轴突的坏死，神经纤维髓鞘的崩解有一定的保护作用.雪旺细胞（SC）是周围神经系统的胶质细胞，SC在周围神经系统再生过程中起关键作用［2，5，7］ .SC能分泌神经营养因子，产生细胞外基质和细胞粘附分子等，这些物质都与神经再生有密切关系［16］ .本实验应用含多种神经营养因子的体外无血清培养的乳鼠雪旺细胞上清浓缩液，经检测具有较高的蛋白浓度（45g・L-1 ）［11］ ，在视神经夹伤后马上将SCNA注入大鼠夹伤眼玻璃体内，发现在夹伤后1wk内能够减缓视神经纤维的变性和坏死速度，与对照组相比差异显著.
CNTF和SCNA仅在早期起作用可能在于:①视神经夹伤后仅在损伤当时玻璃体内一次给药，药物有效浓度及保留时间不明;②损伤后的修复与再生需要多个因子参与，单纯CNTF或SCNA不能够长期起作用;③由于本实验是将重组人CNTF应用于大鼠，可能会因种属差异导致CNTF作用降低.CNTF组和SCNA组间在各个时间点均无明显差异，表明在本组实验条件下两者对视神经损伤后的修复起着相似的作用.
参考文献
［1］Han JS.Theneurosciencecompendium ［M］.Beijing:Science and Technology Press，1993:2-3，35，117-121.
［2］So KF，Aguayo AJ.Lengthy regrowth of cut axons from gan-glion cells after peripheral nerve transplantation into the retina of adult rats ［J］.Brain Res，1985;328（2）:349-354.
［3］Cook MW，Levin LA.Traumatic optic neuropathy.A meta-analysis ［J］.Arch Otolaryngol Head Neck Surg，1996;122（4）:389-392.
［4］Tsai RK，Wang HZ，Sheu MM.Capability of neurite regenera-tion of retinal explant from adult rat after optic nerve injury ［J］.Kao Hsiung I Hsueh Ko Hsueh Tsa Chih（Kaohsiung J Med Sci），1998;14（5）:274-249.
［5］Mey J，Thanos S.Intravitreal injections of neurotrophic factors surport the survival of axotomized retinal ganglion cells in adult rats in vivo ［J］.Brain Res，1993;602（2）:304-317.
［6］He C，Lu CL，Ao SZ.Evolving of ciliary neurotrophic factor study ［J］.Shengli Kexue Jinzhan（Biophisiol Sci Devel），1996;27（1）:53-56.
［7］Gu LQ，Zhu JK，Gu XF.Research of Schwann cells neu-rotrophic agent ［J］.Zhonghua Xianwei Waike Zazhi（Chin J Microsurg），1993;16（2）:125-128.
［8］ Liebrmen AR.Some factors affecting retrograde neuronal response to axonal lesions ［R］.In assays of the Nervous System（Bellairs G and Gray EG eds）.Clarendon Press，Oxford，1974:
71-105.
［9］Sanchez RM，Dunkelberg GL，Quigley HA.The number and diameter distribution of axons in the monkey optic nerve ［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1986;27（5）:1342-1350.
［10］Yang L，Li MY.The human eye’s neural histology study:Counting of optic nerve fiber and measuring of optic disk diame-ter and area ［J］.Zhonghua Yandibing Zazhi（Chin J Ocular Fundus Dis），1999;15（1）:16-22.
［11］Huang W，Hui YN，Liu B.The effect of Schwann cells neu-rotrophic agent to injuried rat retinal ganglion cells ［J］.Zhonghua Yandibing Zazhi（Chin J Ocular Fundus Dis），2000;16（1）:45-47.
［12］Lesseu S.Inderect optic nerve trauma ［J］.Arch Ophthal，1989;107（3）:382-386.
［13］Cui Q，So KF，Yip HK.Major biological effects of neurotrophic factors on retinal ganglion cells in mammals ［J］.Biol Signals Recept，1998;7（4）:220-226.
［14］Paxinos G.The rat nervous system ［M］.New York:Academic Press，1995:833-838.
［15］Cui Q，Lu Q，So KF.CNTF，not other trophic factors，pro-motes axonal regeneration of axotomized retinal ganglion cells in adult hamsters ［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1999;40（3）:760-766.
［16］Raisman G.Use of Schwann cells to induce repair of adult CNS tracts ［J］.Rev Neural Paris，1997;153（8-9）:521.