作者：马晓莉 姜鸿彦 黄维国 邱建华 王锦玲 刘顺利
【关键词】 庆大霉素
关键词: 庆大霉素;前庭;感觉上皮;蛋白激酶C;豚鼠
摘 要:目的 研究庆大霉素慢性损伤后豚鼠前庭终器蛋白激酶C（PKC）活性的变化及其βⅠ ，βⅡ ，γ亚型的表达，探讨PKC与前庭损伤修复的关系. 方法 采用免疫细胞化学法观察椭圆囊斑、球囊斑和壶腹嵴PKCβⅠ，Ⅱ ，γ亚型的表达;应用γ-32 P示踪检测前庭终器PKC活性的变化. 结果 PKCβⅠ，Ⅱ ，γ亚型在前庭感觉上皮细胞均呈阳性表达，上皮下结缔组织呈阴性表达.βⅡ ，γ亚型较β1 亚型表达稍弱，不同亚型抗原分布不完全相同.与对照组相比，PKCβⅠ ，γ在停止注射庆大霉素后1d其表达明显减弱，随后其表达逐渐增加，至1wk其表达已高于对照组，3wk仍未恢复.PKCβⅡ 表达各组变化不明显.豚鼠前庭终器PKC活性检测结果与PKCβⅠ ，γ表达变化规律基本相似. 结论 庆大霉素慢性中毒后豚鼠前庭感觉上皮PKCβⅠ ，γ亚型表达及PKC活性均发生变化，且不同亚型抗原分布不完全相同.提示PKC在前庭感觉上皮损伤修复过程中发挥重要作用，不同亚型可能具有不同的作用.
Keywords:gentamicins;vestibule;epithelium;protein ki-nase C;guinea pigs
Abstract:AIM To investigate the PKC expression and ac-tivity after chronic gentamicin toxicity in vestibular terminal organs of guinea pigs and to study the relations between PKC and injury repair process of vestibule.METHODS By using immunohistochemical method，the expressions of PKCβⅠ and PKCγwere examined in ginea pig macula utriculus，macula sacculus and crista ampullaris.Theγ-32 P was used as a tracer to measure the activity of PKC in vestibular terminal organs.RESULTS The positive expression of PKC isoformsβⅠ，Ⅱ andγwas detected in vestibular sensory epithelium.There was negative staining in connective tissue lying under epithe-lium.The stain of PKC isoformsβⅡ andγwas weaker than that of PKCβⅠ .The antigen distributions of different PKC isoforms were different.In comparison with control group，the expression of PKCβⅠ andγdecreased at1d after injection of gentamicin and then it increased gradually.The expression was obviously higher than control group at1wk after injec-tion and it still did not recover at3wk after injection.There were no obvious differences in expressions of PKCβⅡ among different groups.The change trend of PKC activity was simi-lar to the expression change of PKCβⅠ andγas a whole.CONCLUSION There were some changes of PKC expres-sion and activity in vestibular terminal organs of guinea pigs after chronic gentamicin toxicity and the antigen distributions of different PKC isoforms were different.PKC may play a significant role in injury repair process of vestibule sensory epithelium and different PKC isoforms may have different physiological functions respectively.
0 引言
前庭毛细胞的损伤是引起前庭系统疾病的主要原因之一.如何促进前庭毛细胞损伤的修复，已成为治疗前庭疾病的关键所在.近年来的研究已经证实前庭毛细胞在受到损伤时会出现凋亡现象，并且毛细胞损伤以后可以部分再生，从而促进前庭结构和功能的恢复［1-4］ .但是在毛细胞凋亡、增殖和分化过程中，会受到多种因素的影响，这些因素又必须通过复杂的细胞内信号转导通路，将信息传至核，激活或抑制下游基因组的表达才能发挥作用.我们采用免疫细胞化学法观察椭圆囊斑、球囊斑和壶腹嵴PKCβⅠ，Ⅱ ，γ亚型的表达，并应用γ-32 P标记底物检测前庭终器PKC活性的变化，目的在于从胞内信号转导水平探索前庭感觉上皮的损伤修复机制.
1 材料和方法
1.1 材料 青年健康花色豚鼠44只，雌雄不拘，耳廓反应灵敏，体质量350～450g，由本校实验动物中心提供.PKCβⅠ，Ⅱ ，γ亚型多克隆抗体购于Sant Gruz公司，SABC试剂盒购于博士德公司，PKC活性检测试剂盒购于Gibco公司，γ-32 P ATP由北京市亚辉生物医学工程公司提供，硫酸庆大霉素注射液由本校西京医院制剂中心生产.
1.2 方法
1.2.1 实验分组及前庭损伤动物模型的建立 24只豚鼠随机分为对照组和实验组，每组4只，用于灌注切片;另取20只豚鼠行PKC活性检测，每组4只.对照组动物每日ip生理盐水1mL，实验组每日ip庆大霉素150mg・kg-1 ，连续15d.分别于停药后1，3，7，14和21d处死实验组和对照组动物，其中PKC活性检测不设14d组.
1.2.2 切片的制备 采用20g・L-1 的戊巴比妥钠30mg・kg-1 ip麻醉，40g・L-1 多聚甲醛灌注，取出双侧听泡，解剖显微镜下行蜗管内灌注固定，40g・L-1 多聚甲醛中继续固定24h，100g・L-1 ED-TANa2 溶液中脱钙10d，250g・L-1 蔗糖溶液中脱水3d，固定、脱钙、脱水均在4℃进行，在其过程中各行真空抽气10min.组织块在恒低温切片机中用OCT包埋，平行于蜗轴切片，每片厚10μm，取经过椭圆囊斑、球囊斑、壶腹嵴的切片行PKCβⅠ，Ⅱ ，γ亚型免疫组化染色和常规HE染色.
1.2.3 免疫组化染色 采用ABC法.阳性对照采用豚鼠脑组织，阴性对照以PBS代替一抗.
1.2.4 组织样本处理及蛋白激酶粗提物的制备 豚鼠断头处死，迅速取出双侧听泡，解剖显微镜下剥离出椭圆囊、球囊和半规管壶腹，液氮速冻，-80℃冰箱保存.实验时取出每组6只动物共12只耳的前庭终器，加入预冷的提取缓冲液（20mmol・L-1 Tris，pH7.5，0.5mmol・L-1 EDTA，0.5mmol・L-1 EGTA，25mg・L-1 的亮抑酶肽和抑酶肽），冰浴中匀浆，4℃800r・min-1 离心10min，弃沉淀，继续离心100000g×60min，上清用于测定胞质PKC的活性，沉淀加入含5g・L-1 Triton X-100提取缓冲液，4℃放置30min，再离心100000g×60min，上清用于测定膜相PKC的活性.蛋白定量用考马斯亮蓝法. 1.2.5 PKC活性的检测 参照文献［5］的方法，按照Gibco公司PKC活性检测试剂盒操作说明书进 行.酶活性以每毫克蛋白每分钟转移的32 P的pmol数计算（pmol・min-1 ・mg protein-1 ）.
2 结果
2.1 PKCβⅠ，Ⅱ ，γ亚型免疫组化染色 PKCβⅠ 在前庭感觉上皮包括基底层的支持细胞和位于腔面的毛细胞染色均呈阳性.胞膜和胞质均有阳性表达，但阳性染色并不均匀，胞膜比胞质表达更强，感觉上皮的底层有小团块状的强阳性表达，包绕在细胞周边.感觉上皮下结缔组织呈阴性表达（Fig1）.与对照组相比，在停止注射庆大霉素后1d前庭感觉上皮的胞质和胞膜表达均明显减弱，随后其表达逐渐增加，至1，2和3wk其表达已高于对照组（Fig2～4）.PKCβⅡ 表达和PKCβⅠ 表达有所不同，胞膜染色略强于胞质，感觉上皮的顶层表达略强于其底层（Fig5），各组内表达相差不显著.PKCγ的表达则较弱，胞核着色更深，表达变化规律与PKCβⅠ 相似（Fig6～8）.各组内球囊斑和壶腹嵴与椭圆囊斑染色结果相同.
2.2 PKC活性变化 豚鼠前庭终器膜相、胞质PKC活性在慢性庆大霉素中毒后1d均明显下降，3d，1wk和3wk其活性升高，但胞质PKC活性仍低于对照组，而膜相PKC活性高于对照组.总PKC活性变化规律与膜相相似（Fig9）.
3 讨论
前庭器官体积小，重量轻，直接检测酶活性存在很大难度.本实验将一组内4只动物共8只耳的前庭终器当作一份标本进行检测，所得结果实际上代表着8只耳前庭器的平均酶活性，一定程度上消除了个体差异的影响.PKCβⅠ，Ⅱ ，γ亚型在前庭感觉上皮包括基底层的支持细胞和位于腔面的毛细胞染色均呈阳性，而感觉上皮下结缔组织呈阴性表达，同时进行酶活性检测取材时只带入了非常少量的非前庭感觉上皮组织，因此我们可以认为前庭终器的PKC酶活性测定在某种程度上代表了前庭感觉上皮的PKC酶活性.
PKCβⅠ 在前庭感觉上皮的底层有小团块状的强阳性表达，包绕在细胞周边.从其位置来看很可能是前庭神经纤维末梢，但不能肯定，尚需进一步证实.PKCβⅠ，Ⅱ ，γ亚型在豚鼠前庭感觉上皮中表达强度和表达模式不完全相同，提示PKC不同亚型在其生理活动中发挥着不同的作用.
现在已经了解PKC是由一个大基因家族编码的蛋白，至少有10几种PKC的亚型已经被分离鉴定.在细胞培养和体外实验的条件下都证明PKC存在于细胞膜和细胞质中，胞质中的呈钝化状态.在细胞中的钙离子浓度稍微升高的情况下PKC可以从细胞质转移到特殊部位，如细胞骨架、突触后树突、细胞核和浆膜，而成为待激活态.PKC与专一激活物结合后发生选择性转位.在Ca2+ 、磷脂酰丝氨酸（PS）和二酰基甘油（DG）存在的情况下，PKC与这些因子结合成为活化的复合物PKC・PS4 ・DG・Ca2+ .激活的PKC则可对其底物蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基进行磷酸化，最后导致一定的生理效应.当胞外刺激信号消失后，DG首先从复合物上解离下来而使酶钝化.因此PKC的激活过程是一个动态过程.佛波醇酯因具有与DG相类似的结构而使PKC激活，但在细胞内却很不易降解，而使PKC处于持续的激活状态［6］ .
PKC参与的生理过程极为广泛，既涉及许多细胞的“短期生理效应”，如细胞的分泌、肌肉的收缩等，也参与细胞的蛋白质合成、DNA合成以及细胞的生长分化等“长期生理过程”.PKC的长期活化状态往往参与细胞的长期生理过程的调节，如细胞的分裂和分化、成熟、再生等.PKC参与细胞损伤修复的有许多报道.例如，在培养的垂体腺瘤细胞中加入PKC抑制剂可以增加细胞的凋亡［7］ .PKCα活性的下调可以明显的减少神经胶质瘤细胞增殖，增加细胞凋亡［8］ .PKC也可能与耳蜗损伤后听觉神经元树突突触的修复有关系［9］ .
我们实验中观察到PKCβⅠ 和PKCγ在庆大霉素慢性中毒后1d胞膜及胞质PKC表达减少，而后逐渐升高，这与PKC活性变化趋势基本一致.提示庆大霉素能抑制PKC的表达，PKC活性降低也可能与其某些亚型表达减少有关.停药后1wk，3wk PKCβⅠ 和PKCγ表达高于对照组，膜相PKC活性亦高于对照组，而胞质PKC活性仍低于对照组，提示在此阶段PKC处于持续激活状态，可能参与前庭毛细胞的损伤修复过程.
近年来的研究已经证实哺乳动物前庭毛细胞在受到损伤时会出现凋亡的增加，并且毛细胞损伤以后可以部分再生，从而促进前庭结构和功能的恢复.为进一步了解前庭毛细胞在庆大霉素慢性损伤后PKC表达及活性变化与其凋亡和再生的相关性，我们还同时用末端脱氧核苷酸转移酶介导的尿嘧啶脱氧核苷酸缺口末端标记法（TUNEL）来观察细胞凋亡，用5-溴脱氧尿核苷（BrdU）免疫细胞化学法观察细胞增殖 （资料待发表）.结果发现庆大霉素慢性损伤后1d前庭毛细胞凋亡最多，而后逐渐减少，3wk时仍有凋亡存在;开始时主要是支持细胞增生（3d），随后支持细胞增生与毛细胞增生共存（1wk），2wk和3wk时主要是毛细胞增生.此结果提示前庭毛细胞在庆大霉素慢性损伤后PKC表达及活性变化与其凋亡和再生具有伴随性，可能PKC在前庭毛细胞的损伤修复过程中发挥着重要调控作用.但是PKC是如何被激活以及通过什么样的通路来调节毛细胞的凋亡、增殖和分化尚需进一步的研究.
目前关于前庭感觉上皮损伤修复过程中信号转导的研究尚属空白，系统研究豚鼠前庭损伤修复过程中的信号转导途径，可望明确前庭细胞损伤修复的分子机制，为前庭系统疾病防治的研究提供理论依据.
参考文献
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