作者：杨麦贵，杨阳，郝晓柯，张竹映，郑善銮，樊爱琳，程晓东，周铁成
【关键词】 ，一氧化氮
【Abstract】AIM: To study the relationship between the nitric oxide (NO) and the γglutamyltransferase (GGT) activity of human sperm. METHODS: Sperm routine analysis was conducted following WHO standard. Eightynine subjects were devided into 4 groups according to the density and activity of sperm. A coppered reduced cadmium fluometric assay was used to detect nitrate， a metablic product of nitric oxide in sperm. The activity of sperm GGT was detected by Glucana method. RESULTS: The content of NO had a significantly negative relationship with the density， the motility rate， and GGT activity of sperms in the 89 infertile patients (r =-0.56， -0.63， -0.71， P&<0.01). CONCLUSION: The detection of the activity of sperm GGT is an effective index to assess the capability of sperms being fertilized. NO inhibits the activity of sperm GGT and affects the maturity and motility of sperms.
【Keywords】 nitric oxide; gammaglutamyltransferase; sperm
【摘要】 目的： 探讨人精液中一氧化氮（NO）与γ谷氨酰基移换酶（γglutamyltransferase， GGT）活性的关系. 方法： 参照WHO标准，进行精液常规分析，按精子密度(×109/L)、活动率(%)不同分为（正常，&<20， &<20~40， &>40）4个组. 采用镀铜镉还原荧光法检测NO代谢产物硝酸盐（NO-3）. 用以Glucana为底物动力学方法测定精液GGT活性. 结果： 89例不育者NO含量为（78.5±1.5） μmol/L，与精子密度（33.3±14.3）×109/L，活动率（33.3±14.3）%及GGT活性（203.19±35.89）×103 nkat/L呈显著的负相关（r分别为-0.56， -0.63， -0.71， P&<0.01）. 结论： 精液GGT活性测定是评价附睾头部功能的重要指标，提示NO对精液GGT活性有抑制，从而灭活影响精子的成熟和运动能力.
【关键词】 一氧化氮；γ谷氨酰移换酶；精子
0引言
γ谷氨酰基移换酶(γglutamyltransferase， GGT)是一种广泛存在于哺乳动物体内肾、胰、肝及男性生殖系统等组织中的移换酶，尤其附睾头部活性最高，约为血中的400倍. 催化水解谷胱甘肽，生成γ谷氨酰与游离氨基酸或肽结合，实现跨精子膜转移，起细胞膜连结作用. 当附睾GGT活性降低时，可影响精子的成熟和精子的运动，因此，检测精液GGT对了解附睾头部功能有重要意义［1］. NO是生物活性物质，参与多种疾病的生理病理过程. 它分布于睾丸、附睾及输精管等组织中，对生精过程，精子活力、活率、受精能力等具有重要的调节作用［2，3］. 为探讨其两者在男性不育症中的相互关系，我们对临床119例精液样品进行了检测分析.
1材料和方法
1.1材料
正常生育组男性30例均为有生育能力的自愿献精者，年龄21～30(25.5±1.0)岁. 不育组89例，选自西京医院泌尿外科、中医科和妇产科门诊就诊患者，均为已婚同居2 a以上，性生活正常不育者（排除女方不孕原因及男性附睾疾病），年龄21～31（26.0±1.0）岁. 仪器： 7170全自动生化分析仪（日本HITACH公司生产），960CRT荧光分光光度计（上海分析仪器厂产品）.
1.2方法
1.2.1精液的采集受试者禁欲3～5 d，用新洁尔灭消毒手及尿道口，以手淫法获取1次全部精液，放入一次性无菌干燥带盖塑料容器内，置37℃恒温水浴箱中，孵育30 min，待完全液化后，3000 r/min离心20 min，去除精子（用显微镜确定精液上层无精子存在）. 取上层精液0.1 mL加生理盐水4.9 mL（50倍稀释）混匀，进行GGT和NO含量的测定.
1.2.2精液常规分析取液化精液，参照WHO标准［4］，由2名熟练工作人员分别进行精子计数、精子活动率、活力及形态观察，取其均值. 然后将不育男性按精子密度不同分为：&<20×109/L， (20～40)×109/L和&>40×109/L 3组;按精子活动率分为: &<20%， 20%～40%和&>40% 3个组，生育男性精子密度为(50～100)×109/L，精子活动率为60%～90% . 测其NO含量及GGT活性.
1.2.3精液GGT活性的检测采用上海复星长征医学科学有限公司提供的Glucana为可溶性底物动力学方法试剂盒. 样品中的GGT催化底物中Lγ谷氨酰3羧基4硝基苯胺和甘氨酰甘氨酸生成谷氨酰甘氨酰甘氨酸和呈色产物5氨基2硝基苯甲酸盐，后者的速率与样品中GGT活性成正比. 取50倍稀释好的精液0.5 mL，置7170全自动生化分析仪上，设定主要分析参数，连续监测时间2.63 min，反应温度37℃，主波长405 nm，副波长660 nm ，样品量8.0 μL测定GGT，即可计算出样品中GGT的活性.
统计学处理： 检测结果的计量数据用x±s表示，组间比较采用方差分析，同时用直线回归和相关法比较它们之间的关系.
2结果
2．1精子不同密度的GGT活性及NO含量间的关系30例正常生育组和89例不育各组，精子GGT活性与精子密度呈显著性正相关（r分别为0.69， 0.75， 0.82， 0.90，P均&<0.01），而与NO含量呈负相关（r分别为-0.49， -0.56， -0.63， -0.71， P均&<0.01）. 不育各密度组精子GGT活性随密度增加而上升，NO含量是随密度增加而下降(Tab 1).表1不同精子密度与GGT活性及NO含量间的关系（略）
2．2精子不同活动率GGT活性及NO含量间的关系30例健康生育组精子活动率和89例不育各组精子活动率，与精子GGT活性呈显著性正相关（r分别为0.65， 0.76， 0.88， 0.96， P均&<0.01），而与NO含量呈显著负相关（r分别为-0.50， -0.58， -0.68， -0.76， P均&<0.01， Tab 2).表2不同精子活动率与GGT活性及NO含量间的关系（略）
不育各精子活动率组GGT活性随精子活动率增加而上升，NO含量是随精子活动率增加而下降.
2．3GGT活性与NO含量间的关系30例生育组GGT活性为（443±41）×103 nkat/L，NO含量为（42.3±1.5） μmol/L，与不育组（203±49）×103 nkat/L和（80.4±1.6） μmol/L相比有显著性差异（P&<0.01）. 经相关性分析显示，GGT活性与NO含量呈显著性负相关（Y=27.965-0.869X， Fig 1）.
3讨论
GGT是男性生殖系统组织器官中一种活性较高的酶. 主要分布在睾丸支持细胞基部间质和附睾上皮细胞，上皮细胞具有分泌和浓缩GGT的作用. 精子在附睾头部成熟过程中，尤其是合成膜蛋白和体内各种蛋白例如运动蛋白等需要各种氨基酸和重要的肽类，附睾头部含有高浓度的游离氨基酸和肽，高活力的GGT能催化水解谷胱甘肽，生成的γ谷氨酰再与游离的氨基酸或肽结合，随后实现跨精子膜转移. 当GGT活性减低可影响精子在附睾头部成熟过程中对游离氨基酸及重要肽的利用，发生精子成熟障碍，运动能力下降［1］. 我们的实验结果同样显示精液中GGT活性与精子密度、存活率显著性相关，不育各组精液中GGT活性随精子密度及活率减少而下降，与正常生育组有显著性差异（P&<0.01），表明精液中GGT对精子成熟和精子的运动具有重要作用.
NO在体内是通过一氧化氮合酶(nitric oxide synthase， NOS)由L精氨酸合成. 是一种不稳定的小分子有害气体，当高浓度时对精子具有毒性作用，抑制精子的运动能力. 用单克隆抗体免疫组化技术研究发现，在人的睾丸、附睾和输精管组织中存在NOS，定位于睾丸精母细胞、间质细胞和支持细胞的胞膜上及附睾和输精管组织中的上皮细胞［6］. 本结果表明正常生育组NO含量明显低于不育各组，随精子密度、活率变化而变，NO含量越高而精子密度和活率越低，这证明NO对精子确有抑制和损害作用. 过量的NO可灭活三羧酸循环的乌头酸酶、线粒体逆电子体系中的还原型辅酶Ⅱ脱氢酶和琥珀酸脱氢酶，从而抑制能量合成，精液GGT同样会受到抑制. 我们的实验证明不育组NO含量随精液GGT活性下降而增高，二者呈显著性负相关，存在有密切的关系. 认为NO对GGT有灭活作用，能妨碍精子成熟和影响精子的正常运动. 确切机制还有待进一步研究.
【
参考文献
】［1］闫玉华，张永良. 人精浆中蛋白质检测进展［J］.中国优生与遗传杂志，2003;11(3):13-14.
Yan YH， Zhang YL. Evolve human jism protein backcheck ［J］. Chin J Birth Health Heredity， 2003；11（3）：13-14.
［2］杨麦贵， 张竹映，郝晓柯 ，等. 白细胞精子症患者精液中IL2，8及NO的变化［J］. 第四军医大学学报， 2003; 24(1): 76-77.
Yang MG， Zhang ZY， Hao XK， et al. Sperm IL2，8 and NO in patients with leukocytospermia ［J］. J Fourth Mil Med Univ， 2003;24(1):76-77.
［3］ 杨麦贵，郝晓柯，杨阳，等. 人类精液中一氧化氮和转铁蛋白含量检测的关系［J］. 第四军医大学学报，2004;25(8):725-727.
Yang MG， Hao XK， Yang Y， et al. Relation of nitric oxide and transferring content in human semen［J］. J Fourth Mil Med Univ， 2004;5(8):725-727.
［4］杨麦贵，张竹映，郑善銮，等. 一氧化氮与白细胞精子症不育的关系探讨［J］. 细胞与分子免疫学杂志，2002；18（6）：634-636.
Yang MG， Zhang ZY， Zheng SL， et al. Relationship between nitric oxide and leucocyte sperm disease infertility［J］. Chin J Cell Mol Immunol， 2002;18(6):634-636.
［5］ 杨麦贵， 张竹映，郝晓柯 ，等. 锌对精子受一氧化氮损害的保护作用［J］. 第四军医大学学报，2003；24（16）：1454-1456.
Yang MG， Zhang ZY， Hao XK， et al. Zinc abolishes injurying influence of NO on sperms ［J］. J Fourth Mil Med Univ， 2003;24(16):1454-1456.
［6］ 李克，黄宇烽. 一氧化氮对精子的调节作用及影响［J］. 中华男科学，2001；7（3）：181-184. 转贴于