作者：徐少勇，郭光云，王家宁，黄永章
【关键词】 胃肿瘤
【Abstract】 AIM: To explore the therapeutic effects of antimonials on solid tumor by observing the effects of potassium antimonyl tartrate（PAT）on the proliferation and apoptosis of human gastric cancer SGC7901 cells in vitro. METHODS: MTT method was used to measure the levels of the proliferation of SGC7901 cells intervened with PAT of different concentrations. The cell apoptosis was detected by Hoechst 33 258 and flowcytometry. RESULTS: PAT inhibited SGC7901 cell growth significantly in a dose and time dependent manner. PAT displayed prominent inhibitory effects with 20 and 40 μmol/L at 72 hours， and the growth inhibition rates of the cancer cells reached 54.1% and 66.6%， respectively. SGC7901 cells chromatin condensation and nuclear fragmentation were seen under fluorescence microscope in the cells stained with Hoechst 33 258. The apoptosis rate was the highest with 40 μmol/L PAT at 48 hours， reaching 35.2%. Compared with that of the control group， the cell percentage of G0/G1 phase decreased and that of G2/M phase increased (24.6% vs 5.4%). CONCLUSION: PAT significantly inhibits the proliferation and induces the apoptosis of SGC7901 cells.
【Keywords】 antimony potassium tartrate; stomach neoplasms; cell pision; apoptosis
【摘要】 目的： 通过观察酒石酸锑钾（PAT）在体外对人胃癌SGC7901细胞增殖和凋亡的影响，探讨重金属锑剂对实体瘤的治疗作用，为PAT用于临床治疗胃癌提供实验依据及理论基础. 方法： 采用MTT法检测不同浓度PAT对人胃癌SGC7901细胞的生长增殖的影响；应用流式细胞术和Hoechst 33 258染色后荧光显微镜检测细胞凋亡. 结果： 5， 10， 20， 40 μmol/L PAT能明显抑制胃癌细胞增殖，抑制作用呈时间和剂量依赖性. 20， 40 μmol/L PAT作用72 h细胞的生长抑制率分别是54.1% 和66.6%； Hoechst 33 258染色显示PAT作用后，细胞核出现明显的凋亡形态学改变；流式细胞仪检测到凋亡峰，凋亡率以40 μmol/L作用48 h最大，达35.2%. 同时G2/M期细胞明显增多，以对照组的5.4%，增至24.6%. 结论： PAT能抑制SGC7901细胞增殖并诱导细胞凋亡.
【关键词】 酒石酸锑钾； 胃肿瘤； 细胞分裂； 脱噬作用
0引言
胃癌晚期预后差，长期存活率低［1，2］，5 a生存率仅15%~25%［3］. 大多数胃癌患者诊断时已到进展期，需接受化疗，但常规化疗药物的效果不理想. 因此，寻找新的药物有重要临床意义. 最近的研究发现微摩尔浓度的锑剂［酒石酸锑钾（potassium antimonyl tartrate， PAT）、三氧化二锑］能显著抑制白血病细胞、恶性B淋巴细胞生长，而对正常的淋巴细胞无影响，被认为是一个潜在的、有价值的治疗血液系统恶性肿瘤的药物［4-7］. 但锑剂对其他实体瘤细胞的作用尚不清楚. 我们选用不同浓度的酒石酸锑钾作用于人胃癌SGC7901细胞，观察其对胃癌细胞增殖和凋亡的影响.
1材料和方法
1.1材料
PAT购自SigmaAdrich公司， 用三蒸水配制成1×10-2 mol/L储存液. 使用时用RPMI1640培养基配成工作浓度; Hoechst 33 258， PI（碘化丙啶）， RNase购自Sigma公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)购自北京华美公司；RPMI1640培养基、小牛血清购自Gibco公司；使用Olympus BX 51荧光显微镜∑960酶标仪 Coulter Epics XL流式细胞仪. SGC7901人胃癌细胞株购自中科院上海细胞生物所. 用RPMI1640培养液（含100 mL/L小牛血清，100 ku/L青霉素和链霉素）37℃， 50 mL/L的CO2孵箱中常规培养.
1.2方法
1.2.1ＭＴＴ法检测细胞增殖取对数生长期细胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化成单细胞悬液，调整细胞密度为3×107/L，接种于96孔培养板，每孔加200 μL的细胞悬液，细胞培养24 h贴壁后，加入PAT. 设阴性对照组和不同浓度PAT实验组（5， 10， 20， 40 μmol/L）. 每组均设立4个复孔. 培养24， 48， 72 h每孔加入5 g/L MTT（PBS配制）20 μL再培养4 h，吸弃上清，加入DMSO 200 μL，震荡10 min. 于酶标仪490 nm处测量吸光度A值. 上述实验重复3次，取其均值. 计算细胞增殖的抑制率=（1-实验组A值）/对照组A值×100%.
1.2.2Hoechst 33 258染色观察细胞核变化取指数生长期的细胞，以2×109/L密度接种于含消毒盖玻片的6孔板中，培养24 h细胞贴壁后加入上述浓度的PAT. 24， 48 h后吸尽培养液，加入固定液(甲醇V∶冰醋酸V＝3∶1) 0.5 mL，固定10 min，去固定液，用PBS洗2遍. 加入5 mg/L Hoechst 33 258 0.5 mL，染色5 min. 紫外光激发，荧光显微镜观察并照相.
1.2.3流式细胞仪检测细胞周期和凋亡细胞处理同前. 收集药物作用24， 48 h后的细胞，PBS漂洗，700 mL/L乙醇4℃固定过夜，离心去乙醇，PBS漂洗，加入1 g/L RNase 200 μL于37℃消化30 min，加入50 mg/L PI 200 μL于4℃染色1 h，流式细胞仪检测，采用Muticycle软件分析细胞周期.
统计学处理： 所有数据均采用x±s表示，采用SPSS10.0软件处理系统进行统计分析. 各组间细胞生长抑制率比较采用方差分析;两两比较用SNKq检验.
2结果
2.1细胞增殖PAT能明显抑制体外培养的SGC7901细胞生长，其抑制率随时间延长和浓度升高而升高，存在时间效应和剂量效应关系. 5， 10， 20， 40 μmol/L PAT处理SGC7901细胞72 h的抑制率分别为19.5%， 38.4%， 54.1%和66.6% (Fig 1).
2.2细胞形态Hoechst 33 258染色后，在荧光显微镜下观察，见对照组细胞所发荧光较弱，较均匀；而经PAT作用24， 48 h后的SGC7901细胞出现核固缩，呈致密强荧光，DNA浓缩并向核膜靠拢，少数细胞核碎裂成块状 （Fig 2）.
3讨论
锑剂（PAT、三氧化二锑）能显著抑制白血病细胞、恶性B淋巴细胞生长，而对正常的淋巴细胞无影响. 其机制为诱导细胞凋亡［4-7］. 我们发现5 μmol/L PAT作用24 h后就能抑制体外培养的胃癌SGC7901细胞的生长，且其抑制细胞增殖在一定范围内，随PAT的浓度增加，作用时间的延长，细胞增殖抑制率相应增加. 为进一步研究PAT用于胃癌的化疗提供了可能.
细胞凋亡异常在肿瘤发生发展中具有重要作用，人们致力于开发新的药物以选择性诱导肿瘤细胞凋亡［8］. 我们发现PAT可诱导细胞凋亡. PAT作用后的SGC7901细胞呈典型细胞凋亡形态学改变： 染色质边聚，胞核固缩，碎裂. 流式细胞仪检测可见凋亡细胞形成的亚G1峰，其凋亡率与药物浓度成正比，提示呈剂量依赖性诱导细胞凋亡. PAT作用后，细胞周期也发生明显变化，其中G2/M期细胞增加，G0/G1期细胞减少. 近年来的研究表明，G2/M期阻滞的发生与细胞凋亡关系密切，G2/M期阻滞可能使受损DNA在染色体分离前得到修复，修复成功的肿瘤细胞继续进入增殖周期，不能修复者则进入凋亡途径［9］. 推测PAT可能作用于细胞G0/G1，使G2/M 期细胞阻止，从而诱导细胞凋亡.
综上所述，PAT可抑制SGC7901细胞增殖和诱导细胞凋亡. 有望老药新用，将其应用于胃癌治疗.
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