作者：逯彩虹，田秀珠，周艾琳
【关键词】 不明原因复发性流产
【Abstract】 AIM: To investigate the roles and significance of endometrial TH1/Th3 cytokines in pregnancyimmunity tolerance. METHODS: Fortythree cases of healthy women and forty cases of women with unexplained recurrent spontaneous abortion (URSA) were studied by immunohistochemical method using monoclonal antibody to IL2， IL6 and TNFα， and in situ hybridization method using digoxinlabeled probe of IL2 mRNA and IL10 mRNA. RESULTS: ① The increasing positive levels of endometrial epithelioglandular IL2， IL2 mRNA throughout proliferative， secretory and early pregnancy periods in URSA women were both significantly higher than those of healthy women (IL2：F=75.291， P&<0.01； IL2 mRNA：F=93.972， P&<0.01). ② The increasing positive levels of endometrial TNFα were seen throughout menstrual cycle and early pregnancy in both healthy and URSA women， but the level of TNFα in the three periods were not all significantly statistical different between the healthy and URSA women (F=1.071， P&>0.05). ③ In contrary to IL2 and IL2 mRNA， the increasing levels of endometrial epithelioglandular IL6 and IL10 mRNA throughout menstrual cycle and early pregnancy in healthy women were observed and were both significantly higher than those of URSA women (IL6：F=94.421， P&<0.01； IL10 mRNA：F=269.752， P&<0.01). CONCLUSION: IL2 has an immune exclusive role in human pregnancy and is responsible for URSA. TNFα may be good to the proliferation， growth and development of endometrium. IL6 and IL10 play positive and immune nutritious roles in normal pregnancy. The results provide the clue that the successful pregnancy is closely related to the balance of TH1/Th3 cytokines in maternalfetal tolerance.
【Keywords】 TH1/Th3 cytokines；unexplained recurrent spontaneous abortion
【摘要】 目的： 探讨TH1/Th3型细胞因子在妊娠免疫耐受中的作用及意义. 方法：采用免疫组化及原位杂交技术对43例正常育龄妇女及40例原因不明复发性流产妇女月经周期内膜及早孕蜕膜TH1型细胞因子（IL2，TNFα），Th3型细胞因子（IL6，IL10）进行标记和分析. 结果：①IL2，IL2 mRNA在复发性流产妇女增殖期、分泌期、早孕期子宫内膜腺上皮中的表达逐渐增高，且明显高于正常妇女组(IL2：F=75.291， P&<0.01； IL2 mRNA：F=93.972， P&<0.01). ②肿瘤坏死因子α(TNFα)在正常与流产组月经周期内膜及早孕期蜕膜中的表达均呈现逐渐增多趋势，但两组之间TNFα的表达均无显著性差异(F=1.071， P&>0.05). ③与IL2， IL2 mRNA相反，IL6， IL10 mRNA在正常妇女月经周期内膜及早孕蜕膜中的表达均逐渐增多，且明显高于复发性流产组(IL6：F=94.421， P&<0.01； IL10 mRNA：F=269.752， P&<0.01). 结论：IL2在妊娠中起免疫排斥作用，过量表达会导致复发性流产；TNFα可能参与子宫内膜的增殖、生长及发育；IL6，IL10在正常妊娠中起着积极的免疫营养作用. 此结果提示：成功的妊娠有赖于母胎界面免疫耐受中TH1/Th3型细胞因子的平衡.
【关键词】 TH1/Th3型细胞因子；不明原因复发性流产
0引言
近年来人们认为母胎界面TH1/Th3型细胞因子平衡网络在妊娠免疫调节中起着重要的作用，我们采用免疫组化及原位杂交技术观察几种重要TH1/Th3型细胞因子在正常与原因不明复发性流产妇女月经周期内膜及早孕蜕膜中的表达及其动态变化，进一步探讨它们与妊娠的关系及不明原因复发性流产的病因.
1对象和方法
1．1对象
1．1．1复发性流产组选择200004/200110于山西医科大学附属一院就诊的原因不明复发性流产患者40例. 其中增殖期10例，分泌期13例，早孕期17例，平均年龄(29.1±3.8)岁. 符合以下条件：月经规律，无先天性生殖系统畸形及异常，内分泌功能正常（性激素测定未见异常），无生殖道感染及肿瘤，夫妇双方染色体核型正常.
1．1．2正常妇女组同期选择自愿参与本实验的正常育龄妇女43例，月经规律，妇科相关检查未见异常，既往无不良孕产史，至少有1次正常足月分娩史. 其中增殖期11例，分泌期14例，正常早孕妇女18例，平均年龄(28.6±2.7)岁.
1．2方法
1．2．1标本采集及初处理无菌操作采用刮匙轻轻刮取增殖期、分泌期内膜及早孕期蜕膜直径1~3 cm大小各2~3块. 无菌纱布吸取血迹置于40 g/L多聚甲醛液中固定6~8 h，常规脱水石蜡包埋，实验前连续切片.
1．2．2SABC法
1．2．2.1试剂鼠抗人的IL2，IL6，TNFα mAb SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司.
1．2．2.2实验步骤载玻片用防脱水剂APES处理，4~6 μm连续切片，置烤箱60℃烤2 h，使组织与载玻片紧密黏附. 切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化至水，30 g/L过氧化氢室温孵育10~15 min，微波炉92℃修复10 min，血清封闭37℃ 30 min后，依次滴加一抗（鼠抗人mAb IL2， IL6， TNFα）4℃过夜，二抗（羊抗鼠lgG）37℃孵育30 min，三抗SABC（链霉素抗生物蛋白一过氧化酶）37℃ 30 min. DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片，中间洗涤采用PBS缓冲液.
1．2．3原位杂交法
1．2．3.1试剂地高辛标记的IL2，IL10核苷酸探针原位杂交检测试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司.
1．2．3.2实验步骤杂交载玻片用含1 g/L DEPC的APES处理，4~6 μm连续切片，置烤箱60℃烤2 h，使组织与载玻片紧密黏附. 切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化至水，30 g/L过氧化氢室温孵育10~15 min，30 g/L柠檬酸胃蛋白酶37℃消化50 min后，依次滴加预杂交液（37~42℃ 4 h），杂交液（37℃过夜），封闭液，生物素化鼠抗地高率，SABC，生物素化过氧化物酶各自37℃ 30 min，DAB显色，苏木素复染，中间洗涤采用SSC及PBS缓冲液.
1．3结果判定原位杂交及免疫组化染色阳性均为胞质黄色棕褐色染色，不着色为阴性，每张切片随机选取数个高倍视野（×400）计数500个腺上皮细胞中阳性细胞所占的百分率.
统计学处理： 采用SPSS统计软件处理，所有百分数均平方根反正弦转换， 采用析因设计方差分析，观察各种细胞因子在两组之间表达的差异，每组内多期均数间的详细比较采用q检验.
2结果
2.1IL2及IL2 mRNA在流产妇女增殖期内膜表达极少，分泌期增多，早孕期内膜呈现多个腺上皮胞质强烈棕黄色染色（Fig 1，P&<0.01）. 正常妇女各期IL2，IL2 mRNA表达均很少（Fig 2）. 两组之间表达比较：复发性流产组IL2及IL2 mRNA的表达均高于正常妇女组(IL2：F=75.291， P&<0.01； IL2 mRNA：F=93.972， P&<0.01).
2.2TNFα正常妇女与流产妇女增殖期内膜腺上皮TNFα表达均很少：分泌期增多持续到早孕期（Fig 3， 4， P&<0.01），但两组之间TNFα表达无显著性差异（F=1.071， P&>0.05）.
2.3IL6及IL10 mRNA与IL2相反在正常妇女月经周期内膜及早孕蜕膜腺上皮表达均呈现逐渐增多趋势（Fig 5，6， P&<0.01），而IL6， IL10 mRNA在流产妇女月经周期内膜及早孕蜕膜中的表达均较少. 两组之间IL6， IL10 mRNA表达比较：正常妇女组IL6， IL10 mRNA的表达明显高于流产组(IL6：F=94.421， P&<0.01； IL10 mRNA：F=269.752， P&<0.01， Tab 1）.表1两组妇女月经周期及早孕期4种细胞因子表达水平比较（略）
TH1/Th3型细胞是1986年mosmann等在研究小鼠CD4+辅助细胞时发现的两个亚型. TH1细胞分泌IL2，IFNγ，TNFα等TH1型细胞因子介导细胞免疫参与急性移植排斥反应，具有抗胞内病原体、抗病毒［1］、抗肿瘤［2］等作用. Th3型细胞分泌IL4，5，6，10等Th3细胞因子介导体液免疫参与同种移植免疫耐受，它们相互作用、相互协调构成TH1/Th3型细胞因子平衡网络共同维持正常体内免疫应答及正常妊娠的顺利进行，此平衡网络的失调会导致类风湿关节炎，系统性红斑狼疮等全身免疫性疾病及胚胎停育，妊高征等病理性妊娠［3，4］.
IL2是较重要的TH1型细胞因子之一，本次研究显示：IL2 mRNA，IL2在复发性流产妇女子宫内膜中的表达明显高于正常妇女组，差异均有显著性（P&<0.01），此结果提示：IL2与复发性流产的发生密切相关. 体外研究发现IL2可使占子宫骨髓来源白细胞70%［5］的uNK细胞中CD16抗原的表达使其活化为杀伤力强的CD16+ CD56+ uNK细胞，并可使其转化为具有细胞毒作用的LAK细胞损害胎盘与胎儿组织［6］. THFα是另一个重要的TH1型细胞因子，除有抗肿瘤作用外，还介导炎症反应及免疫反应，有其广泛的生物学活性. 本研究发现：TNFα在流产及正常妇女月经周期内膜及早孕蜕膜中的表达均逐渐
增多，差异均有显著性. 此结果说明：TNFα参与子宫内膜的增殖、生长、发育. TNFα可诱导IL1，TGFβ，CSF，LIF等参与细胞分化和生长的细胞因子的产生并与它们共同诱导细胞黏附分子在子宫内膜中的表达，参与内膜形态学变化、增殖，为胚胎植入提供所需的内膜微环境. 但两组增殖期、分泌期、早孕期TNFα表达经t检验均无显著性差异（P&>0.05）. 提示：①两组内膜中TNFα表达水平低而导致无显著性差异. ②TNFα以其复杂的生物学特性在妊娠免疫调节中发挥多种作用，有待于进一步探讨和研究. 与IL2相反，本实验显示： IL6，IL10 mRNA在正常妇女子宫内膜中的表达明显高于复发性流产组. 说明：IL6，IL10是人类正常妊娠的重要调节因子. IL10被称为细胞因子抑制因子主要抑制TH1型细胞因子IL2，TNFα等的产生从而抑制母胎界面的排斥反应. 另外IL10还可诱导垂体细胞及脾细胞分泌促肾上腺皮质激素（ACTH）促进肾上腺糖皮质激素产生介导免疫耐受［7，8］. Mastuakin等报道：妊娠时IL6可调节胎盘HCG的合成和转化生长因子TGFβ一起共同参与不对称封闭抗体（LgG）的产生，此封闭抗体竟争性地牢固结合父方抗原形成无免疫效应的抗原抗体复合物，从而封闭父方抗原免遭母体免疫排斥.
综上所述，流产组IL2表达高，而IL6，IL10 mRNA表达水平低，反之正常妇女内膜除有IL6，IL10 mRNA高水平表达外，伴有IL2表达的抑制. 而TNFα在两组内膜中表达低且无显著性差异，可见TH1型细胞因子IL2，TNFα与Th3型细胞因子IL6，IL10以其复杂的多种生物学活性在月经周期及早孕期的不同阶段相互调节、相互抑制、共同维持正常妊娠的顺利进行. 正常妊娠是以Th3型细胞因子免疫调节为主的，当发生Th3型向TH1型细胞因子免疫调节偏离时将会导致复发性流产. 细胞因子制剂用于习惯性流产动物模型的免疫治疗以及习惯性流产的临床主动免疫治疗已取得了较好的效果［9］，具有广阔的前景，对于TH1/Th3型细胞因子在妊娠免疫调节中作用及机制的深入研究对各种病理性妊娠的病因探讨及临床免疫治疗将提供有益的帮助.
参考文献
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