作者：周芙玲，黄辰，宋土生，倪磊，王爱英，牛月英，李明众
【关键词】 辣根过氧化物酶
【Abstract】 AIM: To evaluate the effects of indole3acetic acid （IAA） oxidated by horseradish peroxidase （HRP） on the proliferation and malondialdehyde （MDA） level of HeLa cells. METHODS: HeLa cells were incubated by HRP/IAA（IAA 20， 40， 60， 80， 100 μmol/L and HRP 1.2 mg/L） at various time points. The inhibition of proliferation activity， colonyforming rate， proliferation index， apoptosis rate， MDA level and morphological change of HeLa cells were detected by means of trypan blue dye， MTT reduction assay， colonyforming assay， flow cytometry， TBA test and QWin550CW microscope. RESULTS: HRP/IAA had a significant timeeffect and doseeffect reliance on the inhibition of proliferation and degradation of MTT in HeLa cells. The cell cycle of HeLa cells affected by HRP/IAA was investigated at 6 h， 24 h， 48 h and 72 h， respectively. It was showed that， with the increase of IAA concentration， HRP/IAA accelerated apoptosis and decreased the number of the HeLa cells in G0/G1 stages while increased the number of the HeLa cells slightly in S and G2/M stages. Colonyforming rate and protein reduced remarkably when IAA concentration increased， but MDA level rose. The changes of cell morphology were obvious after 72 h incubation with HRP/IAA. CONCLUSION: IAA oxidised by HRP has a rapid cytostatic effect on HeLa cells and enhances the lipid peroxidation.
【Keywords】 indole3acetic acid; horseradish peroxidase; HeLa cells; proliferation; MDA; apoptosis
【摘要】 目的： 研究辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）激活吲哚乙酸（indoleacetic acid，IAA）后产生的细胞毒性作用对HeLa细胞增殖及丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平的影响. 方法：取不同处理时间点体外培养的人宫颈癌HeLa细胞，经不同终浓度的IAA（分别为20，40，60，80，100 μmol/L）和同一终浓度的1.2 mg/L HRP共同处理后，依次用台盼蓝拒染法、生长抑制实验、集落形成实验、流式细胞术、TBA法及QWin550CW显微镜，检测活细胞数、抑制率、集落形成率、增殖指数、凋亡率和MDA含量，观察细胞形态学变化. 结果： HRP激活的IAA对HeLa细胞生长及降解MTT的能力均有较强的抑制作用，在一定的浓度范围内，呈现明显的时效和量效关系. 在6， 24， 48和72 h检测细胞周期，处理组随着IAA浓度增加，细胞凋亡率增加，S期和Ｇ2/Ｍ期细胞比率增加，Ｇ0/Ｇ1期细胞比率下降. 随着IAA浓度的增加，HeLa细胞集落生成率逐渐减少，集落体积变小，各处理组蛋白含量显著降低，MDA含量增加，细胞形态学的变化在72 h最明显. 结论：HRP激活的IAA可能通过促进细胞进入分裂期，同时加速脂质过氧化程度的机制来诱导HeLa细胞凋亡.
【关键词】 吲哚乙酸； 辣根过氧化物酶； HeLa细胞； 增殖； 丙二醛； 凋亡
0引言
吲哚乙酸（indoleacetic acid ，IAA）是高等植物体内最常见的生长激素，能够影响植物细胞的生长、分裂及分化等［1］. 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase HRP）有助于激活IAA产生细胞毒性，从而具有杀灭癌细胞的能力［1，2］. 我们以HeLa细胞为模型，探讨HRP激活IAA后的生物学效应及对脂质过氧化程度的影响，为进一步研制IAA抗肿瘤药物奠定基础.
1材料和方法
1.1材料
主要试剂和仪器: HeLa细胞株购自中科院上海细胞所. RPMI 1640干粉培养基为美国Gibco公司产品； 新生牛血清为杭州四季青公司产品； 四甲基偶氮唑盐(MTT)和碘化丙啶（PI）为Sigma公司产品； 二甲基亚砜(DMSO)为Amresco公司产品；IAA由上海生化试剂公司提供，4℃保存，临用时用培养液稀释至所需浓度. 考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒和丙二醛（MDA）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所. 德国BMG Labtechnologies公司的高功能多通量微板测试系统；美国BD公司的流式细胞仪FACSCalibur；德国Leica公司的QWin550CW型图像信号采集与分析系统.
1.2方法
1.2.1细胞培养RMPI 1640基础培养液中加入100 mL/L的新生牛血清， 1×105 u/L青霉素，100 mg/L链霉素， HeLa细胞株接种在RMPI 1640培养液中，置于CO2孵箱（37℃，50 mL/L）中培养，3～4 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验.
1.2.2生长曲线的测定空白对照A组为正常生长HeLa细胞；对照B组HeLa细胞单独加入的IAA终浓度20 μmol/L；对照X1组HeLa细胞单独加入的HRP终浓度1.2 mg/L. 实验组X2，X3，X4，X5及X6中IAA的终浓度分别为20，40，60，80，100 μmol/L，HRP终浓度1.2 mg/L，用于激活IAA产生细胞毒性. HeLa细胞2×105个接种于24孔板中，总体积1 mL. 共记数4日，每日取3孔细胞用4 g/L台盼蓝拒染法计活细胞数，绘制细胞生长曲线.
1.2.3生长抑制实验(MTT法)HeLa细胞2×104个接种于96孔板中，加入不同终浓度IAA及HRP 1.2 mg/L，总体积200 μL. 分别培养24， 48， 72及96 h，加入MTT 20 μL，4 h后弃培养液，每孔加入DMSO 150 μL，微量振荡器振荡10 min， 高功能多通量微板测试系统(波长570 nm)上测量A值，计算细胞生长抑制率. 计算方法为:抑制率=(1－实验组平均A值/对照组平均A值)×100%.
1.2.4流式细胞仪检测细胞周期收集实验组及对照X1组分别培养6， 24， 48和72 h的细胞，1000 r/min离心5 min，PBS洗两次， 轻轻打匀细胞，预冷的700 mL/L乙醇1 mL固定. 检测时PBS洗两次，各样本加入含有Rnase的PI 200 μL，置4℃避光染色30 min，400目尼龙网过滤后，以激发波长488 nm测定，用multicycle软件分析细胞周期，并求出细胞增殖指数(PI)和凋亡率(AP). 计算方法为:PI(%)=(Ｓ+Ｇ2/Ｍ)/(Ｇ1+Ｓ+Ｇ2/Ｍ)×100%.
1.2.5集落形成实验细胞浓度每孔50个，接种于24孔培养板中，总体积1 mL，每组设6个平行孔，培养10 d，吉姆萨染色后计算细胞集落数(&>50个细胞为1个集落).
1.2.6形态学观察细胞接种在放有盖玻片的培养皿中培养，加入HRP及不同终浓度的IAA， 96 h内定时在倒置显微镜下直接观察. 72 h用德国Leica公司的QWin550CW型图像信号采集与分析系统采集照片；同时对培养细胞进行HE染色，摄片.
1.2.7硫代巴比妥酸法(TBA)测定MDA收集各实验组及对照X1组培养72 h的细胞，超声破碎制成细胞匀浆，编号后严格按说明书要求操作. 样本蛋白和MDA含量计算公式：蛋白含量(g/L)=测定管A-空白管A〖〗标准管A-空白管A×标准管浓度(g/L)MDA含量(μmol/L)=测定管A-测定空白管A〖〗标准管A-标准空白管A×标准品浓度(10 μmol/L)÷蛋白含量(g/L)
统计学处理： 原始数据采用SPSS 11.0统计软件包进行频数统计和重复测量设计方差分析.
2结果
2.1激活的IAA对HeLa细胞生长的影响以不同剂量处理HeLa细胞时发现，细胞的生长明显受到抑制，生长曲线(Fig 1)显示从传代24 h已经出现实验组生长曲线下移，而单独加入IAA 20 μmol/L和HRP 1.2 mg/L对生长曲线无明显影响.
2．2生长抑制实验从Tab 1可以看到HRP激活IAA后，对HeLa细胞降解MTT的能力均有较强的抑制作用. 在处理24 h时，生长抑制表现为低浓度IAA具有较高作用；而在48～72 h，处理组的细胞生长抑制率逐渐呈现剂量效应. 随着处理时间的延长，高浓度组细胞生长抑制率有增加的趋势.表1细胞生长抑制率随时间和药物浓度的变化（略）
2．3细胞周期在6， 24， 48和72 h细胞周期的检测结果显示，Ｇ0/Ｇ1期细胞总数有下降趋势，Ｇ2/Ｍ期和S期显著增多， AP增加，DNA直方图上出现典型的亚二倍体凋亡峰. 方差分析结果显示，在48 h时间段G2/M期在IAA 各浓度之间出现明显的差异，PI及AP等之间无显著性差异.
2．4激活的IAA对HeLa细胞集落形成的作用当HRP 1.2 mg/L，随着培养时间延长，高浓度的IAA使HeLa细胞集落生成率逐渐减少，且集落体积变小. 集落生成抑制作用在72 h明显，IAA 100 μmol/L与HRP 1.2 mg/L作用至10 d，集落形成明显受抑，只有很少的细胞形成克隆团，之后生长减缓以至死亡(Fig 2).
2．5HeLa细胞的形态学变化倒置显微镜下直接观察，HeLa细胞体积随IAA浓度增加而变小，细胞边角减少，逐渐变为圆形，胞内颗粒增多，胞膜完整，部分细胞膜表面有小泡形成，培养液中有许多漂浮的呈虫蚀样及桑椹样细胞，72 h后上述改变更为明显. QWin550CW型图像信号采集与分析系统示72 h上述改变，放大20倍(Fig 3A～H)，X1和X6组放大40倍(Fig 3I，J). A组、B组和X1组细胞无显著改变. HE染色显示:细胞体积明显缩小，梭状边角减少，细胞膜上出现小泡及胞膜皱缩，胞质变少，红染，细胞核明显固缩， X1组和X6组见Fig 4，5.
2．6TBA法测定MDA结果随着IAA浓度的增加，处理各组样本蛋白含量显著降低，MDA含量升高，在72 h明显（Tab 2）.表2测定72 h各组HeLa细胞上清液中蛋白和MDA（略）
近年来，寻找有效抗肿瘤药物成为研究的热点. 1998年Folkes等［2］发现，IAA和HRP结合后对V79小鼠细胞有细胞毒作用，而单独加入IAA或HRP均无细胞毒作用. 此后有文献报道［3］ HRP有助于激活IAA产生杀灭癌细胞能力， 而且人体可以耐受较大剂量IAA. Kim等［4］报道在一定的浓度范围内，激活的IAA对人黑色素瘤G361细胞生长有较强的抑制作用，呈现明显的时效和量效关系，而抗氧化剂可以阻止这一过程. 本实验HeLa细胞经IAA和HRP处理后作细胞培养，显示生长曲线下移，有增殖抑制趋势，而单独加入IAA或HRP均无抑制效应，与报道一致. MTT法是从能量代谢角度观察细胞增殖情况，激活的IAA对HeLa细胞降解MTT的能力有较强的抑制作用. 细胞凋亡与肿瘤发生、发展与消退有密切关系，某些抗肿瘤药物抗肿瘤作用的强弱与它们诱导肿瘤细胞凋亡的活性呈正比. 因此，诱导肿瘤细胞凋亡成为寻找抗肿瘤药物的新靶点，以及评价疗效的一项新指标［5，6］. 流式细胞术分析发现在细胞增殖周期中，Ｇ0/Ｇ1期、S期以及Ｇ2/Ｍ之间存在着影响细胞周期进行的控制点，而药物可能通过调控这些控制点来影响细胞增殖，不同的药物可影响细胞周期的不同阶段. Greco等［7］用HRP cDNA转染人膀胱癌T24细胞，观察到HRP激活的IAA 对细胞分裂周期各阶段均有抑制作用. 本研究结果与之不同，对照组G1期在6 h和24 h高于其他处理组，在48 h和72 h保持平稳，而S期和Ｇ2/Ｍ期细胞总比率随IAA浓度增加而有所降低. 处理组凋亡率增加表明，对HeLa细胞的杀伤作用增强. 以上结果暗示，IAA的杀伤作用可能主要发生在细胞增殖期. 氧自由基不但通过生物膜中多不饱和脂肪酸的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂质过氧化物的分解产物引起细胞损伤. HRP激活IAA产生活性氧［8］，而MDA是植物中鉴定IAA起源的主要产物［9］. MDA水平可直接反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度［10］. 自由基引发的氧化损伤与其致癌作用密切相关，Folkes等［11］研究发现IAA及其许多衍生物如3亚甲基2羟吲哚等被HRP氧化，导致细胞损伤， DNA断裂，培养的哺乳动物细胞的集落形成能力丧失. 本研究与报道相符，随着IAA浓度的增加，激活的IAA可有效降低HeLa细胞集落形成率. 处理各组样本蛋白含量显著降低，MDA含量升高，并呈现明显的剂量效应，提示自由基反应增强，HeLa细胞损伤的程度逐渐加重，肿瘤特性降低.
参考文献
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