【摘要】 目的： 探讨一氧化氮（NO）及一氧化氮合酶（NOS）在兔脑缺血再灌注损伤中的作用及机制. 方法： 采用阻断双侧颈总动脉30 min的方法建立急性兔前脑缺血模型，观察脑组织NO含量和NOS活性变化. 结果： 脑缺血再灌注过程中NO， NOS呈“双峰样”改变. 脑缺血30 min NO含量和NOS活性显著升高，缺血60 min时两者下降；分别在脑缺血后30 min和60 min再灌注时，NO含量和NOS活性再次升高. 结论： NO和NOS通过多种途径参与了脑缺血再灌注损伤的病理过程.
【关键词】 脑缺血再灌注；一氧化氮；一氧化氮合酶
0引言
一氧化氮（NO）是生物体内近年来颇受关注的、新型的细胞信息分子，广泛参与机体心血管、免疫、神经等系统的生理和病理调节过程. NO是由左旋精氨酸和分子氧在一氧化氮合酶（NOS）的催化下生成的. 该酶有3种类型： 即神经元型（nNOS）、内皮型（eNOS）和诱导型（iNOS）. 前两者属结构型（cNOS），是生理存在形式，依赖Ca2+或钙调蛋白，作用快速短暂，生成NO少. iNOS在脑缺血状态下过度表达，作用时间长，NO产生较多［1］. 近年来研究发现，NO在脑缺血损害中发挥重要作用［2］，但在缺血再灌流情况下，脑组织中NO含量及NOS活性有何变化，国内报道较少. 我们利用动物病理模型，观察兔急性前脑缺血再灌注时脑组织NO含量和NOS活性的变化，探讨了NO， NOS在脑缺血再灌注损伤中的作用及机制.
1材料和方法
1.1材料
筛选健康新西兰白兔30只(南阳高等医学专科学校动物中心提供)，3 ~ 4月龄，体质量2.0～2.5 kg，雌雄兼用，随机分为假手术组、缺血30 min组、 缺血30 min再灌注30 min组、缺血60 min组、缺血60 min再灌注30 min组. 每组6只. 表1脑缺血再灌注时脑组织NO含量和NOS活性变化比较（略）
1.2方法
动物用25 g/L戊巴比妥钠（1 mL/kg）iv麻醉，固定于兔手术台上，颈部正中切口，分离双侧颈总动脉，用无损伤微动脉夹夹闭双侧颈总动脉30 min（或60 min），此为缺血期；30 min（或60 min）后撤去双侧动脉夹，即恢复血供形成再灌流. 缺血达到以下标准： 即夹闭双侧颈总动脉10 s左右，兔出现意识丧失、角膜反射和翻正反射消失，并在30 min缺血期内，意识和上述反射均未恢复者，方可实施再灌注. 在缺血期死亡或仅出现昏睡以及整个实验过程出现抽搐的兔均被弃去. 假手术对照组仅分离颈总动脉，不阻断血流. 各组兔按规定时间点以空气栓塞处死，迅速取出额顶背外侧皮质或对照组相同部位脑组织约0.1 g，加冰生理盐水制备100 g/L的脑匀浆. 匀浆液在10 000 r/min， 4℃下离心20 min，取上清液置-20℃冷藏. NO的最终代谢产物NO2-， NO3-，故采用硝酸还原酶法，特异性地将NO3-还原为NO2-，后者与Griess试剂反应生成紫红色化合物，其颜色深浅与NO的含量呈正比. 通过比色测定NO的含量. NOS活性测定采用分光光度法. 组织NOS定义为： 每克组织蛋白每秒生成1 nmol NO为nkat/g. NO和NOS试剂盒由南京建成生物工程研究所提供. 组织蛋白质测定采用Lowry法［3］. 转贴于 统计学处理： 所得数据用x±s表示，组间差异比较采用方差分析及LSD检验.
2结果
脑缺血30 min组NO含量和NOS活性显著高于对照组（P＜0.01），而缺血60 min组NO含量明显下降接近对照组， NOS活性虽下降但仍比对照组高（P＜0.05）. 分别在脑缺血后30 min和60 min两个时间点再灌注30 min时，脑组织NO含量和NOS活性再次上升，均高于相应的缺血组.
3讨论
NO 是由L精氨酸和分子氧在NOS催化下生成的，是一种正常生理状态下存在的信息分子，在维持神经元功能的完整性、脑血流及微循环内环境恒定等方面起着重要的作用. 新近研究认为： 由于NO在生物体内的浓度、产生部位和时间、作用部位的不同及其氧化还原状态等复杂的生物学性质，决定其在中枢神经系统中，既有潜在的脑保护又有神经毒性的双重作用，犹如一把“双刃剑”. NO可激活鸟苷酸环化酶，使平滑肌细胞cGMP增多，舒张脑血管、调节脑血流［1］；控制血小板聚集和黏附［3，4］；氧化状态的NO，能调节离子通道，减少胞质游离Ca2+水平而发挥脑保护作用. 而还原型的NO可迅速与超氧阴离子反应生成毒性更强的自由基，导致膜功能失调；过量的NO又可通过多种信号转导途径引起神经损害，加重脑缺血损伤. NO表现神经保护或是毒性作用与其氧化还原状态，及其生成量是否达到能引起病理性损害的程度和患者体内环境的变化有关. 本研究结果显示，兔脑缺血再灌注过程中，脑组织NO含量和NOS活性呈独特的“双峰样”改变，该结果与Tominaga在大鼠局灶性脑缺血模型上，利用电子偏振磁共振技术测定结果相似.
在脑缺血早期，由于神经末稍释放兴奋性氨基酸增多，激活N甲基D天门冬氨酸受体（NMDA），使细胞内Ca2+ 超载，依赖Ca2+或钙调蛋白的NOS持续激活［5］；其次，脑缺血缺氧时，ATP耗竭，能量代谢障碍，cAMP依赖性蛋白激酶活性下降，使NOS脱磷酸化而活性增强，合成NO增多，致NO含量和NOS活性的第一次升高，提示NO在缺氧缺血性脑损害中发挥重要作用. 随着缺血时间的延长，脑组织中O2， L精氨酸供给减少，NOS磷酸化及其巯基亚硝基化，故在缺血后60 min时，NOS活性降低，NO合成减少. 当脑缺血再灌流时，O2， L精氨酸恢复供应，细胞内Ca2+ 浓度再次升高，NOS被激活，使NO含量和NOS活性再次升高，形成复氧期的第二次高峰，反映了NO参与脑缺血再灌注期的迟发性病理损害过程. 高浓度的NO可与细胞内含铁硫中心的酶结合使其失活，抑制线粒体呼吸链，能量衰竭；介导其他有细胞毒性的自由基产生［6］，导致膜功能失调；抑制DNA的合成和修复及诱导细胞凋亡；cGMP增多，促使多巴胺的释放，导致更强烈的神经毒性，加速神经元的死亡［3］.
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参考文献
】［1］ 曹非，孙圣刚，童萼塘，等. 左旋精氨酸和一氧化氮合酶抑制剂在大鼠局灶性脑缺血中作用的实验研究［J］. 临床神经病学杂志，2000;13（5）：287-289.
［2］ 王立，徐俊，陈月琴，等. 缺血性脑卒中患者血浆NO浓度变化的研究［J］. 临床神经病学杂志，2001;14（5）：269-271.
［3］ 张洪，慕容慎行，刘友尧，等. 大鼠脑缺血再灌流脑区一氧化氮变化的研究［J］. 临床神经病学杂志，1999;12（1）：18-20.
［4］ 杨霄鹏，娄季宇. 一氧化氮与急性脑梗死的临床相关研究［J］. 河南实用神经疾病杂志，2003;6（3）：34-35.
［5］ 刘伟民，杨晓武. 急性脑血管病患者血清NO， sIL2R含量变化及临床意义［J］. 河南实用神经疾病杂志，2001;4（2）：9-11.
［6］ 张志琳，霍红梅，王运良，等. 进展性脑卒中患者内皮素、一氧化氮含量的变化［J］. 河南实用神经疾病杂志，2004;7（4）：8-9.转贴于