作者：王胜春，胡咏武，王俊琴，李晓玮，贺雪梅
【关键词】 肝损伤
【Abstract】 AIM: To investigate the active components producing the pharmacodynamic effects in WuLing Capsules. METHODS: Liver cells were separated and the model of liver cell injuries was established. The pharmacodynamic role of WuLing capsules was demonstrated by pharmacodynamic test. The chemical components of WuLing capsules were analyzed by HPLC chromatograms and UV spectrum， and the pharmacodynamic effects of four kinds of control substance were observed by the test of cell pharmacodynamics. RESULTS: The DGlaN group active enzyme of ALT， AST， MAO and MDA rose respectively to (881.8±231.7) nkat/L， (1256.9±265.1) nkat/L， (32.3±2.3) nkat/L and (1.0±0.6) μmol/L， which were more marked than those in normal group (P&<0.05). The drug serum in WuLing capsules antagonized the injuries of liver cell induced by DGlaN and the enzyme activeness of ALT， AST， MAO and MDA decreased respectively to (421.8±288.4) nkat/L， (980.2±113.4) nkat/L， (21.7±5.5) nkat/L and (1.5±1.0) μmol/L， notably lower than those in model group (P&<0.05). Four kinds of control substance markedly decreased the level of high enzyme activity that was induced by DGlaN and there were obvious action of restoration and protection on the injuries of liver cells induced by DGlaN. CONCLUSION: Schizandrol A， Schisandrin B， Crytanshinone and Tanshinone ⅡA are effective components of WuLing capsules in retarding the injuries of liver cells.
【Keywords】 WuLing capsule； liver injury； active component
【摘要】 目的： 探讨五灵胶囊产生药效作用的活性成分. 方法： 分离肝细胞并建立肝细胞损伤模型，血清药效学试验证实五灵胶囊药效作用，HPLC色谱和紫外光谱分析含药血清中五灵胶囊化学成分，同时采用细胞药效学试验观察4种对照品的药效作用. 结果： 模型组培养上清ALT，AST，MAO，MDA酶活性分别升高至(881.8±231.7) nkat/L， (1256.9±265.1) nkat/L， (32.3±2.3) nkat/L，(1.0±0.6) μmol/L，与正常组比较（P&<0.05）；五灵胶囊含药血清能有效地拮抗DGlaN对肝细胞损伤，细胞上清液中ALT，AST，MAO，MDA酶活性分别降低至(421.8±288.4) nkat/L，(980.2±113.4) nkat/L，(21.7±5.5) nkat/L，(1.5±1.0) μmol/L，显著低于模型组（P&<0.05）；4种对照品能明显降低由DGlaN诱导肝细胞损伤时所致升高的酶谱活性水平，对DGlaN损伤的肝细胞有显著的修复和保护作用. 结论： 醇甲、乙素、隐丹参酮和丹参酮ⅡA是五灵胶囊阻滞肝细胞损伤的有效活性成分.
【关键词】 五灵胶囊；肝损伤；活性成分
0引言
五灵胶囊是治疗慢性肝炎的有效中药复方制剂［1］，其成分复杂产生药效作用的化学成分难以确定，这对该药质量标准制定的合理性和如何有效地控制产品质量带来了困难，因此探讨该药活性成分成为必要，本实验我们采用含药血清与对照品的细胞药效试验，并结合分析含药血清中化学成分，同时与对照品进行对照试验，来探寻五灵胶囊产生药效作用的化学成分.
1材料和方法
1．1材料
① 动物：SD大鼠，质量（200±20）g，♂（由第四军医大学实验动物中心提供），动物合格证号：医动证字SC×K（军）200205； ② 试剂与试药： D氨基半乳糖（DGLaN）：（重庆医科大学提供）；无酚红 DMEM培养基：（USA.Gibco公司产品）；新生小牛血清（NBS）（杭州四季青提供，用前56℃ 30 min灭活）；二甲基亚砜（DMSO）：（AR，华美物制品公司提供）；甲醇，异丙醇：（色谱醇，TEDIA公司产品）；五味子醇甲（醇甲）纯度：99 %、五味子乙素（乙素）纯度：98%、丹参酮IIA对照品纯度：99%（中国药品生物鉴定所提供）；隐丹参酮对照品由本室分离纯化制备并经氢谱（HNMR）确证，纯度：99%；五灵胶囊：（由西京医院药剂科生产，批号：020207）；③ 仪器：（BB16/贺利气体培养箱，德国HERAES公司）；美国Waters公司600型HPLC系统；2996紫外检测器；2996型二极管阵列检测器；Millenium 32数据处理系统；日本岛津UV 2501型分光光度计；美国MD100生化分析仪.
1.2色谱条件Hypersil C18柱（5.0 mm×150 mm，5 μm）；柱温：室温；流动相：甲醇水（80∶20）；流速：0.8 mL/min；检测波长：270 nm，在此条件下能检出隐丹参酮、乙素、丹参酮IIA并达到基线分离，各成分保留时间隐丹参酮11.3 min、乙素12.9 min、丹参酮IIA 17.6 min.醇甲HPLC分析，流动相：甲醇水（13∶7）；色谱柱、流速、检测波长同上.
1.3含药血清的制备及含量测定取20 wk龄大鼠21只，♂，随机分成空白血清组、含药血清Ⅰ组和Ⅱ组. 空白血清组灌胃蒸溜水10 mL/kg，含药血清Ⅰ组和Ⅱ组分别灌胃五灵胶囊药粉10.0 g/kg和6.25 g/kg，每日1次，连续3 d，第4日给药2 h后，乌拉坦麻醉(ip， 250 mL/L)，无菌操作腹主动脉取血，放置30 min，3000 r/min，离心20 min，分离血清. 含药血清Ⅰ组和Ⅱ组待测化学成分分析：取血清0.7 mL，加硫酸铵0.25 g，再加乙腈甲醇（4∶1） 4 mL，振荡抽提1 min，3500 r/min，离心10 min，取上清液置40℃水浴上氮气吹干，沉淀加甲醇溶解至1 mL，混匀，置EP管中-20℃过夜，次日按色谱条件（HPLC法）分析4种化学成分及含量.另取混合空白血清0.7 mL，共5份，依次加入312.5，62.5，12.5，2.5和0.5 mg/L的对照品溶液，同上法测定各对照品吸收度值并绘制对照品标准曲线.外标法分析含药血清Ⅰ组和Ⅱ组血清中4种化学成分及含量. 余下各组血清按剂量组合并混匀，置56℃水浴灭活30 min，分装于EP管内置-20℃冻存，为体外含药血清药效试验的供试品.
1.4供试品液的制备完全DMEM培养液： 取小牛血清10 mL加DMEM培养液90 mL，备用；0.5 mmol/L DGlaN供试液：精密称取DGlaN 5.38 mg，加完全DMEM培养液溶解至10 mL，微孔滤膜除菌，-4℃冷藏，用时加完全DMEM培养液稀释至50 mL；空白血清供试液：取空白血清与完全DMEM培养液以2∶8混合，即得；含药血清Ⅰ组和Ⅱ组供试液：分取2组含药血清与完全DMEM培养液分别以2∶8混合，即得；4对照品供试液：取用二甲基亚砜溶解至1 g/L各对照品液，加完全DMEM使终浓度100， 50， 25 μg/L 3剂量，用前配制.
1.5血清药效学试验取12 wk龄大鼠2只，♂，腹腔注射250 mL/L乌拉坦麻醉，按程涛等［2］介绍方法操作制备原代肝细胞，肝细胞重悬于200 mL/L小牛血清DMEM培养液中，调整细胞密度为2×106/mL，接种于24孔培养板内，置37℃ 50 mL/L CO2孵箱内培养48 h，换液继续培养12 h，吸弃上清液，分成6组，每组6孔.正常组、 DGlaN组、 空白血清组、模型组、含药血清Ⅰ组和Ⅱ组.正常组、空白血清组加完全DMEM培养液1 mL，其余各组每孔均加0.5 mmol/L DGlaN供试液1 mL，培养24 h，吸弃上清液；正常组、 DGlaN组加完全DMEM培养液， 空白血清组及模型组加200 mL/L空白血清供试液，含药血清Ⅰ组和Ⅱ组分别加含药血清供试液培养20 h，收集取尽培养上清测定ALT，AST，MAO和MDA；各组肝细胞再加完全DMEM培养液继续培养20 h，收集培养上清测定ALT，AST，MAO和MDA，检测含药血清的延迟效应.
1.6对照品对肝细胞修复作用试验细胞制备方法同1.5，分组；正常组、DGlaN组、醇甲+乙素组、隐丹参酮组、丹参酮IIA组；正常组加完全DMEM培养液1 mL，其余各组每孔肝细胞均加含0.5 mmol/L DGlaN供试液1 mL，培养24 h，吸弃上清液.正常组、DGlaN组加完全DMEM培养液1 mL，对照品组每组为3剂量（100，50，25 mg/L），分别加入相应剂量的对照品供试液1 mL，每剂量重复8孔，置37℃ 50 mL/L CO2孵箱内继续培养24 h，收集各组细胞培养上清，测定细胞酶谱活性.
统计学处理： 数据用x±s表示，采用SPSS 10.0软件统计.对Tab 1~4数据进行Kruskalwallis秩和检验，对Tab 5数据行Wilcoxon秩和检验.
2结果
2.1含药血清对DGlaN所致肝细胞损伤的影响在体外培养条件下，原代肝细胞经台盼蓝染色活性为97%，与0.05 mmol/L DGlaN供试液作用24 h，培养上清ALT，AST， MAO和MDA酶活性值均显著高于正常肝细胞组（P&<0.01），肝细胞产生损伤.模型组肝细胞更换含0.05 mmol/L DGlaN的200 mL/L空白血清供试液后其ALT， AST， MAO和MDA值低于DGlaN组，但无显著性差异， 显著高于空白血清组（P&<0.01）. 空白血清组肝细胞ALT和MAO值显著高于正常组（P&<0.01），AST略高于正常组，可使MDA降低并低于正常组，血清可拮抗DGlaN导致肝细胞产生MDA. DGlaN组和模型组均为损伤组，只是模型组含200 mL/L血清之异，以消除试验中血清对药效试验的影响.含药血清Ⅰ组对DGlaN损伤肝细胞所致升高的ALT和AST酶活性值有降低作用，但无显著性差异.含药血清Ⅱ组对DGlaN损伤肝细胞而导致的高酶活性值均有显著降低作用，其作用强于含药血清Ⅰ组，与模型组比较差异显著（P&<0.05，Tab 1），当各试验组弃除各供试液，更换完全DMEM培养液于肝细胞继续培养20 h，观察延迟效应.结果含药血清Ⅰ组对高ALT和AST酶活性值有明显降低作用（P&<0.05），MAO值和模型组相似，MDA值升高. 含药血清Ⅱ组仍能有效地拮抗DGlaN对肝细胞的损伤（P&<0.05，Tab 2）.表1五灵胶囊含药血清对DGlaN所致肝细胞损伤的作用（略）表2五灵胶囊含药血清对DGlaN所致肝细胞损伤的延迟效应（略）
2.2对DGlaN损伤的肝细胞修复作用正常肝细胞在完全DMEM培养液中培养24 h，培养上清中ALT，LDHL， MAO，GSHST及MDA值见Tab 3. 生长稳定的肝细胞加入DGlaN作用24 h后，导致肝细胞损伤，其培养上清中ALT，LDHL， MAO，GSHST及MDA值显著高于正常组（P&<0.01）.对照品醇甲+乙素组3种剂量对由DGlaN所致肝细胞损伤而升高的ALT， LDHL， MAO， GSHST及MDA值有显著降低作用，显著低于模型组（P&<0.05），降MAO， GSHST有量效关系，大剂量组有降MDA作用而中小剂量则无此作用.对照品隐丹参酮和丹参酮IIA均能拮抗DGlaN所致的肝细胞损伤，使DGlaN升高的酶谱活性值显著降低或趋向正常，较模型组差异显著（P&<0.05， Tab 3）.表3各对照品对DGlaN所致肝细胞损伤的修复作用（略）
2.3对照品对DGlaN损伤的肝细胞保护作用醇甲+乙素、隐丹参酮、丹参酮IIA组3种剂量均能拮抗DGlaN对肝细胞的损伤，所测培养上清中酶活性值显著低于模型组（P&<0.01， Tab 4）.醇甲+乙素组降LDHL，MAO， GSHST和MDA有量效关系，隐丹参酮组降MAO和MDA有量效关系.表4对照品对DGlaN所致肝细胞损伤的保护作用（略）
2.4五灵胶囊含药血清中化学成分分析采用对照品平行试验分析，经HPLC色谱和UV光谱确证，大鼠血清中含有五灵胶囊4种化学成分，即醇甲、乙素、隐丹参酮和丹参酮IIA，这4种成分的色谱和UV光谱与相应对照品一致.同时测定两剂量组大鼠血清中4种成分的含量，结果大剂量组血清中醇甲、乙素、隐丹参酮3种化学成分的含量明显低于小剂量组（P&<0.05， Tab 5）， 两剂量组血清中丹参酮IIA含量相似.表5五灵胶囊大鼠血清中4种成分的血药浓度测定（略）
3讨论
中药固有成分经胃肠吸收入血后才能产生作用，从血清探寻中药方剂活性物质是一种可行尝识，血清药理结果表明，空白血清可使肝细胞ALT和MAO酶活性值明显升高，当弃除空白血清更换完全DMEM培养液继续培养24 h，肝细胞酶谱值与正常值相似，而相同剂量的小牛血清则无此作用，鼠血清导致肝细胞ALT和MAO酶值明显升高并非是肝细胞损伤所致，MTT活性试验与镜检观察肝细胞再生现象表明：鼠血清有刺激肝细胞再生作用，ALT与MAO活性增高可能与此有关. 提示空白血清可屏蔽含药血清的作用.模型组肝细胞在含200 mL/L空白血清的0.05 mmol/L DGlaN供试液作用下，ALT由881.8±231.7下降至680.1±140.9，AST和MAO则继续升高，各指标测定值仍显著高于空白血清组，说明肝细胞损伤模型是成功的，正常组、DGlaN组、200 mL/L鼠空白血清组、模型组酶谱值分析证实这点. 含药血清Ⅰ组对DGlaN造成肝细胞损伤所致升高的ALT和AST有降低作用，与空白血清比较无明显差异，降MAO作用显著.含药血清Ⅱ组对DGlaN所致肝损伤有明显地修复作用，所测酶谱指标显著下降， 较空白血清组差异显著（P&<0.05）.延迟效应试验表明:当各实验组弃去上清液，更换完全DMEM培养液于肝细胞培养一定时间测定酶谱，模型组除ALT略下降，AST， MAO和MDA值均增加，说明DGlaN诱导肝细胞损伤仍正在继续， 含药血清Ⅰ组对DGlaN导致的继发性损伤有阻止作用，其ALT和AST值较模型组显著下降，但MAO与MDA值同模型组相似，含药血清Ⅱ组仍对DGlaN继发性损伤有显著阻止作用，这与江艳艳等［3，4］报道体内试验结果一致.结果提示在含药血清内确有五灵胶囊阻止DGlaN对肝细胞产生损伤的活性成分存在.进一步研究显示：HPLC分析含药血清中化学成分，经对照品平行对照试验HPLC色谱和UV光谱确证，大鼠血清中含有五灵胶囊4种成分，即醇甲、乙素、隐丹参酮和丹参酮IIA，4种成分的色谱和UV光谱与相应对照品一致. HPLC所分析血清中4种化学成分是否显现或部分显现五灵胶囊所具有的药效作用，细胞药效试验印证4对照品对DGlaN诱导肝细胞损伤有良好的修复和保护作用.这为前述分析含药血清中五灵胶囊化学成分醇甲、乙素、隐丹参酮和丹参酮IIA是治疗肝损伤的活性成分提供了间接依据.一般来讲，药物经吸收入血在体内产生作用，五灵胶囊为中药复方制剂，其成分复杂而含量甚微，并非任意物质能在血清中测得含量，血清中药物量的存在才能反映了药物有效性，含药血清和细胞药效学实验，以及HPLC分析其化学成分提示醇甲、乙素、隐丹参酮和丹参酮IIA是五灵胶囊治疗肝损伤的活性成分.五灵胶囊10.0 g/kg和6.2 g/kg剂量灌胃给药大鼠，HPLC分析小剂量组大鼠血清中醇甲、乙素、隐丹参酮和丹参酮IIA的浓度大于大剂量组，说明过大的给药剂量造成胃肠吸收减慢，进入血清的成分降低.
【参考文献】
［1］ 孙利，周永兴，连建奇. 五灵胶囊治疗慢性肝炎的临床随访观察［J］. 第四军医大学学报，2000；21（7）：905.
Sun L， Zhou YX， Liang JQ. The follow up study on effect of the chronic viral hepatitis patients treated with WuLing capsule［J］. J Fourth Mil Med Univ，2000；21(7):905.
［2］ 程涛，胡大荣，聂青和，等. 一种改良的Ito细胞分离培养方法［J］. 第三军医大学学报，1999；21（8）：598-600.
Cheng T， Hu DR， Nie QH， et al. A modified method for isolation and culture of Ito cells［J］. Acta Acad Med Mil Tert， 1999；21(8)：598-600.
［3］ 江艳艳，王胜春，蒋永培，等. 五灵胶囊对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤保护作用［J］. 时珍国医国药，2000；11（11）：961-962.
Jiang YY， Wang SC， Jang YP， et al. Protective effects of WuLing capsules on chronic hepatic injury induced by CCl4 in rats［J］. Lishizhen Med Mat Med Res， 2000；11(11):961-962.
［4］ 王胜春，胡咏武，李剑锋，等. 复方中药五灵胶囊对小鼠免疫功能的影响［J］. 第四军医大学学报， 2002；23（16）：1518-1521.转贴于