作者：姜泓，薛莹，高雪，师长宏，柏银兰，张海，李元，徐志凯
【关键词】 结核分枝杆菌
【Abstract】 AIM: To obtain Mycobacterium tuberculosis (MTB) furB from H37RvDNA， express efficiently in E. coli and purify the FurB proteins. METHODS: furB was amplified by PCR from the genome of H37Rv and cloned into pGEMTEasy vector. After sequenced， furB was recombinated into the expression vector pQE80L by restriction enzyme digestion， which was named pQE80LfurB. The plasmid pQE80LfurB was transformed into E.coli DH5α and induced by IPTG. The furB expression was analyzed by SDSPAGE and confirmed by Western blot with micespecific mAb against (His)6. RESULTS: furB was identical to what reported by Genbank. The pQE80LfurB vector expressed protein with relative molecule mass 15.0×103， which could be caught by (His)6 mAb. The expressed protein could be purified by NiNTA system kit with denatured condition. CONCLUSION: furB has been successfully cloned and efficiently expressed in E.coli， The results lay the basis for further study of FurB functions.
【Keywords】 furB; expression; purification; Mycobacterium tuberculosis
【摘要】 目的： 从H37Rv基因组中扩增furB并高效表达和纯化. 方法： 用PCR技术从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增furB序列，将其与pGEMTEasy载体连接转化E.coli DH5α，构建重组克隆载体pGEMTEasy/furB，测序正确后将目的基因片断克隆入pQE80L原核表达载体并转化E.coli DH5α，IPTG诱导目的蛋白表达. 经Western blot鉴定目的基因与(His)6融合表达，将已表达的蛋白质通过Ni2+NTA亲和色谱柱进行纯化. 结果： PCR得到结核分枝杆菌furB，测序结果与Genbank中报道的完全一致. SDSPAGE显示，在Mr为15.0×103处有相应的蛋白质表达条带，Western blot鉴定为(His)6融合表达蛋白. 经Ni2+NTA亲和色谱柱进行纯化后可得到纯化的蛋白. 结论： 成功克隆了铁调节蛋白基因furB序列，并在E.coli DH5α高效表达，亲和层析后获得了纯化目的蛋白.
【关键词】 furB;表达;纯化;结核分枝杆菌
0引言
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis， MTB）在结核病(tuberculosis， TB)患者体内的生长与铁的利用有关. 研究发现，MTB基因组包含了两个相似的铁摄取基因furA和furB. furA主要与其下游的katG基因表达有关， 而furB的功能现在还不清楚．为此，我们在原核表达载体中表达MTB furB并对其进行了纯化，为其功能研究奠定基础.
1材料和方法
1.1材料
MTB毒株H37Rv， DH5α由本室保存; pGEMTEasy及Wizard Plus Purification system购自Promega公司； Xgal， 限制性内切酶BamHⅠ， HindⅢ及T4DNA连接酶，TaqDNA聚合酶均为TaKaRa公司产品；IPTG， DTT， DTE，小量质粒提取试剂盒均为Sigma公司产品，胶回收试剂盒为Vitagene公司产品.
1.2方法
1.2.1引物的设计与合成根据已发表的MTB H37Rv全基因组furB编码区(2641648N，2642040C)序列设计引物. 上游引物P1: 5′GGATCCAGTGCAGCCGGTGTCCGC3′中加入BamHⅠ酶切位点；下游引物P2: 5′AAGCTTCCTTTTGGTGCTGGAGACGG3′ 中加入HindⅢ酶切位点. 引物由上海博亚生物技术有限公司合成.
1.2.2furB片段的扩增取保存于改良罗氏培养基的MTB H37Rv接种于7H9液体培养基，37℃间或振荡培养2~3 wk. 取5 mL液体培养物的菌体沉淀重悬于50 μL裂解液（10×PCR绶冲液5 μL， 45 g/L吐温5 μL， 45 g/L NP40 5 μL， 20 g/L蛋白酶K 0.5 μL及水34.5 μL）中. 于55℃水浴1 h，沸水浴10 min灭活蛋白酶K，离心取上清，用酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，溶于50 μL TE中［1］，作为DNA模板. PCR反应体系为： 10×buffer 5 μL， dNTPs 5 μL (2.5 mmoL/L)、DNA模板为1 μL， P1， P2引物各1 μL (25 μmoL/L)及Taq酶1 μL，加水至50 μL. PCR条件: 94℃变性40 s，56℃复性30 s，72℃延伸50 s， 25个循环.
1.2.3PCR产物的克隆与鉴定PCR产物用琼脂糖凝胶电泳回收DNA条带. 取纯化的PCR产物与质粒pGEMTEasy进行连接反应，转化感受态DH5α， 均匀涂布于含有xgal(33 μL) 和异丙基βD硫代半乳糖苷IPTG(20 μL)的LB培养皿中，37℃培养16 h， 挑取白色菌落进行酶切鉴定，所获阳性克隆命名为pGEMTEasyfurB，送至上海生工生物工程有限公司进行序列测定.
1.2.4目的蛋白的诱导表达经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后与经同样酶切的pQE80L载体进行连接反应， 转化感受态DH5α，挑取的阳性克隆命名为pQE80LfurB. 在含有氨苄青霉素（100 mg/L）的LB培养基中过夜培养pQE80LfurB. 按10%的接种量进行转接，37℃摇菌3 h，加入异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5 mmoL/ L，37℃继续培养4~5 h. 取1.5 mL细菌培养物，8000 g离心30 s收集菌体，加入2×样品缓冲液剧烈振荡混匀，100℃， 5 min；8000 g离心5 min；取上清进行 SDSPAGE电泳检测.
1.2.5表达产物鉴定将经诱导的pQE80LfurB和E.coli DH5α分别制样，进行Western blot分析.
1.2.6表达蛋白的可溶性分析大规模培养细菌，诱导表达目的蛋白，收集细菌，超声破菌. 离心后将上清和沉淀分别制样，进行SDSPAGE分析.
1.2.7表达产物的纯化根据Ni2+NTA试剂盒的说明书， 将融合蛋白与Ni2+NTA结合， 用不同pH值咪唑溶液进行洗脱， 得到纯化产物.
2结果
2.1furB片段的扩增及序列测定经25个循环PCR扩增，可得与预计长度相等的片断（Fig 1）. 将DNA回收后插入pGEMTEasy载体，经测序证实所扩增的furB序列与Genbank数据库所收录的furB序列完全一致.
2.3furB在pQE80L表达载体中的诱导表达将pQE80LfurB经37℃活化过夜，经IPTG诱导表达后做SDSPAGE分析，从电泳图中可以看出在Mr为15.0×103处出现了一条表达带，表达量约占菌体总蛋白的20% (Fig 3).
2.4目的蛋白的鉴定所构建的重组质粒表达的FurB蛋白以带有6个组氨酸的融合蛋白的形式出现，使用鼠抗 (His)6 mAb验证FurB蛋白的表达. 结果显示在Mr为15.0×103处有一显色带，而对照无相应条带 (Fig 4).
2.5表达蛋白的可溶性分析将上清和沉淀分别所制样品，进行SDSPAGE分析表明表达产物主要在细菌裂解后的沉淀中，而上清中则很少(Fig 5).
2.6目的蛋白的纯化纯化的产物经SDSPAGE分析可在Mr为15.0×103处得到一条清晰的条带(Fig 6).
3讨论
由于BCG免疫效果极不稳定［2］，缺乏对MTB致病机制的深刻了解，现在全球已处于结核病的紧急状态［3］. 入侵机体的MTB和宿主的关系是动态的，必须快速适应不利并不断变化的环境. 金属离子的获取对病原菌的复制增殖是必需的. 铁是多种酶的辅因子，参与电子转运和氧化还原反应［4］，在MTB的生长过程中发挥了重要作用. 限制铁的利用可以延缓MTB的生长，同时铁的利用情况可作为反映几种毒性因子表达水平的指标［5］. 相反，铁的无限制地摄取会导致铁中毒和氧化应激从而使细菌停止生长［6］. 病原菌的金属调控蛋白主要有四个不同的簇组成，分别为Fur(ferric uptake regulator)， DtxR(diphtheria toxin repressor)， MerR和ArsR. MTB基因组包含了两个相似的铁摄取基因furA和furB， furA位于katG上游［7］，并与katG其表达调控有关， 而furB的功能还不清楚. 基因序列分析，MTB基因组中的furB比furA更相似于大肠杆菌fur， 因此furB可能是细胞内多种基因表达的一个调控因子.
本实验中应用的pQE80L表达载体为4751 bp，起始码下游接有6个组氨酸，双链环状，Amp抗性，多克隆位点有9个单一限制性酶切位点. PCR产物共有561 bp，其中furB本身有393个碱基，在其终止码的下游的168个碱基为非编码序列. 因此，furB克隆入pQE80L载体中与6个组氨酸融合，可产生共137个氨基酸的融合蛋白，Mr为15.0×103左右，实验结果与理论值相符合. 融合蛋白有(His)6的表达，因此通过检测组氨酸的表达，可间接证明furB表达，同时(His)6的表达为进一步纯化蛋白提供了亲和位点，它可与Ni2+特异性结合，通过Ni2+NTA亲和色谱柱可得到纯化的目的蛋白.
我们成功地在原核表达系统中表达MTB的铁调控相关蛋白FurB， 并进行了初步鉴定和纯化，为进一步研究FurB的功能奠定了基础.
【
参考文献
】［1］ 范雄林，徐志凯，李元，等. 结核分枝杆菌Ag85B成熟蛋白基因免疫［J］. 第四军医大学学报，2001;22(14):1283-1287.
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Jiang S， Zhu DY， Jiang Y， et al. Construction of the fused eukaryotic expression vector of Mycobacterium tuberculosis Ag85B and Ag85A antigens and its expression ［J］. J Fourth Mil Med Univ， 2003;24(21):1973-1975.
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