【关键词】 维生素D依赖性
【Abstract】 AIM: To observe the coexistence of calbindinD28k (CB) with parvalbumin (PV) in neurons of the anterior horn of the spinal cord in rats. METHODS: Immunofluorescence histochemical doublestaining method was used. RESULTS: Some of the medium and smallsized neurons in the anterior horn of the spinal cord showed CB or PVimmunopositive staining. The majority of the CBimmunoreactive neurons also exhibited PVimmunoreactivities， i.e. CB and PV coexisted in these neurons. CONCLUSION: CB and PV coexist in some of the neurons in the anterior horn. CB/PV doublelabeled neurons might belong to Renshaw cells and they may have some feedback inhibitory regulatory effects on the activities of α motor neurons in the anterior horn.
【Keywords】 spinal cord; anterior horn; calciumbinding prtein， vitamin Ddependent; parvalbumins; Renshaw cell
【摘要】 目的： 观察大鼠脊髓前角神经元内维生素D依赖性钙结合蛋白（CB）与小白蛋白（PV）的共存情况. 方法： 免疫荧光组织化学双重标记技术. 结果： 脊髓前角内的部分中、小型神经元呈CB或PV阳性；绝大部分CB阳性的前角神经元亦呈PV阳性，即CB与PV共存于这些神经元. 结论： CB与PV共存于部分前角神经元，这些神经元可能为Renshaw细胞并参与对前角α运动神经元的反馈抑制调控.
【关键词】 脊髓；前角；钙结合蛋白质，维生素D依赖性；小白蛋白；Renshaw细胞
0引言
脊髓前角内除含有运动神经元外，还含有形态各异的中间神经元. 由于这些神经元所含的神经递质或化学成分不同，功能也各异. 目前认为多数中间神经元因发生、发育和所处部位不同，它们常与运动神经元构成局部回路参与姿势反射和运动调节［1，2］；又因为中间神经元含γ氨基丁酸（GABA）等抑制性递质，其主要功能是对运动神经元起抑制作用［3，4］. 维生素D依赖性钙结合蛋白（calbindinD28k， CB）与小白蛋白（parvalbumin， PV）是最常见的和功能比较明确的两种钙结合蛋白（calciumbinding proteins， CaBPs），它们与细胞内Ca2+的存储和释放密切相关，并能调节神经递质的释放和影响代谢［5，6］. Renshaw细胞是数量较多的抑制性中间神经元，以往的免疫组化研究显示其胞体多呈CB阳性［4］，但CB与PV是否共存于Renshaw细胞，未见报道. 我们用免疫荧光组织化学双重标记技术对此进行了观察.
1材料和方法
1.1材料
成年SD大鼠16只，雌雄不拘，体质量250～300 g，由第四军医大学实验动物中心提供.
1.2方法
1.2.1灌注固定戊巴比妥钠（100 mg/kg）腹腔麻醉后开胸，经左心室插管至升主动脉，先用0.01 mol/L磷酸缓冲盐溶液（PBS， pH 7.3）100 mL冲净血液，然后用500 mL含40 g/L多聚甲醛、0.5 g/L戊二醛和2.5 g/L苦味酸的0.1 mol/L磷酸缓冲液（PB， pH 7.3）灌注固定1 h. 灌毕取出脊髓，置入上述新鲜固定液中后固定4 h（4℃），再移入含300 g/L蔗糖的PB中过夜. 将脊髓冠状冰冻切片，片厚20 μm，切片分为4组. 分别收集于0.01 mol/L的PBS（pH 7.3）中. 将第1组切片裱于经明胶处理的载玻片上，5 g/L的中性红染色，以便对照观察.
1.2.2免疫荧光组化染色CB和PV的免疫荧光组化双重染色： 将第2， 3组切片在常温下进行CB和PV的免疫荧光组化双重染色. 步骤如下： ① 分别用兔抗PV血清（1∶8000， Sigma）/小鼠抗CB血清（1∶5000， Sigma）孵育24 h，孵育液为含3 g/L Triton X100和25 g/L正常驴血清的PBS （PBSNDS）； ② Biotin结合的驴抗兔IgG （1∶200， Chemicon）孵育3 h；③ 100 g/L正常兔血清孵育30 min; ④ 5 g/L Avidin结合的Texas Red （Vector）和5 g/L DTAF标记的驴抗小鼠IgG （Chemicon）孵育3 h. 将切片裱于经明胶处理的载玻片上避光干燥，用含500 g/L甘油的PBS封片. 用荧光显微镜（BX60; Olympus）在不同的滤镜下观察Texas Red（激发波长530～580 nm，发射波长≥610 nm）和DTAF（激发波长450～490 nm，发射波长515～565 nm）标记的阳性结构.
2结果
在脊髓不同节段的前角，分别可见呈CB或PV阳性的神经元胞体，尤其在颈膨大和腰膨大处最为明显. CB和PV阳性神经元胞体主要位于脊髓前角内、外侧运动神经元柱（Ⅸ层）之间的Ⅷ层，CB阳性神经元的数量略多于PV阳性神经元. CB和PV阳性神经元的胞体多为圆形、梭形或三角形，最大直径多在10～25 μm之间. CB和PV阳性纤维及终末也比较密集地分布于脊髓前角各节段（Fig 1A， B， C， D）. 绝大多数CB阳性神经元亦呈PV阳性；CB/PV双标神经元的数量较多，它们主要分布于脊髓全长的Ⅷ层（Fig 1A， B， C， D）. 计数结果表明CB/PV双标神经元的数量分别占CB和PV阳性神经元数量的92.6%和95.3%.
3讨论
脊髓前角的灰质中，除了位于Ⅸ层支配梭外肌和梭内肌的α运动神经元和γ运动神经元以外，Ⅷ层内还存在许多形态多样、性质和种类不同的中间神经元，其中的部分小型中间神经元属于轴突短且具抑制效应的Renshaw细胞. Renshaw细胞接受α运动神经元返回轴突侧支的支配，而Renshaw细胞的轴突也与α运动神经元形成抑制性突触联系，借此反馈调控α运动神经元的活动，保持运动的稳定和准确［7，8］.
电生理学实验研究证实脊髓前角内的CB阳性神经元多为中间神经元，大部分CB阳性神经元为Renshaw细胞并含有抑制性神经递质GABA［4］. 还有研究观察到大多数运动神经元表面的CB阳性终末来源于Renshaw细胞，Renshaw细胞的轴突终末与运动神经元形成单突触联系［4］. PV阳性神经元广泛分布于中枢神经系统［4］，PV虽不是典型的神经递质，但可与细胞内的Ca2+高度亲合，调节细胞内Ca2+的浓度，并能通过与Ca2+的结合参与神经元的胞内信号转导，调节Ca2+进入神经元，从而阻止运动神经元处于过度兴奋状态，影响神经元的兴奋性［9］.
本研究利用免疫荧光组化双重标记技术观察到脊髓前角的Ⅷ层内分布着许多分别呈CB或PV阳性的神经元，绝大多数CB阳性神经元亦呈PV阳性. 本研究观察到的CB与PV共存神经元可能属于Renshaw细胞，进一步证实了以往的研究认为CB阳性神经元是Renshaw细胞的观点，并为Renshaw细胞反馈抑制性调控α运动神经元提供了形态学依据.
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