作者：王胜春，张英志，胡咏武，李晓玮，田卫斌
【关键词】 ，五灵胶囊
【Abstract】 AIM: To investigate the effects of WuLing Capsules on liver cell injuries induced by active molecules secreted by Kupffer’s cells. METHODS: Hepatocyte and Kupffer’s cells were isolated and purified from rat livers and then exposed to LPS and DGlan. The changes of hepatocytes and cytokines secreted from Kupffer’s cells were determined in the presence of WuLing Capsules. The protective effects of WuLing Capsule on hepatocyte injuries induced by LPS stimulation of kupffer’s cells were also examined. RESULTS: WuLing Capsules significantly reduced hepatocyte injuries induced by LPS and DGlan exposure and inhibited TNFα， IL6 and IL8 secretion of Kupffer’s cells. The hepatocyte injuries caused by active molecules released from Kupffer’s cells decreased in the presence of WuLing Capsule. CONCLUSION: WuLing Capsule may exert some therapeutic effects by the down regulation of cytokines in chronic hepatitis.
【Keywords】 WuLing capsules； Kupffer’s cells； cytokine； lipoposccharide
【摘要】 目的：探讨五灵胶囊对枯否细胞（Kupffer cells， KC）释放细胞因子介导肝细胞（hepatocellular cells， HC）损伤的作用. 方法：分离并纯化HC与KC并建立LPS及DGlaN损伤肝细胞模型，观察五灵胶囊对2种损伤模型的作用以及对LPS诱导KC释放细胞因子介导肝细胞损伤的作用. 结果：五灵胶囊2个剂量能有效地阻滞LPS，DGlaN损伤肝细胞以及降低LPS诱导KC释放TNFα，IL6，IL8水平，抑制KC释放细胞因子损伤肝细胞. 结论：五灵胶囊遏制KC大量释放细胞因子是治疗慢性肝炎作用机制之一.
【关键词】 五灵胶囊； 枯否细胞； 细胞因子；脂多糖
0引言
慢性肝炎患者血清和肝组织中TNFα，IL6，IL8诱导肝损伤的发生和发展是与集聚在肝脏的KC密切相关，激活KC释放TNFα，IL6和IL8等炎性因子在肝脏免疫病理损害中起着重要作用［1］，以往研究表明五灵胶囊对慢性肝炎患者良好的治疗作用已被临床和实验证实［2，3］. 五灵胶囊治疗肝损伤机制鲜见报道，我们采用大鼠肝细胞与KC细胞为靶细胞，在体外观察五灵胶囊(WuLing)对脂多糖（LPS）和D氨基半乳糖（DGlaN）诱导肝细胞损伤和LPS诱导KC释放因子的作用以及CD14表达，旨在阐明五灵胶囊降酶保肝的作用机制.
1材料和方法
1.1材料
① 动物：SD大鼠，♂，［第四军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：医动证字SC×K（军）200205］；②试剂与药品： RPMI Medium 1640培养基（批号：1080385，USA. Gibco公司）；DMEM・F12培养基（批号：1095578，USA.Gibco公司）；新生牛血清（NBS）（杭州四季青，批号：200206112，用前灭活56℃，30 min）；脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）(USA.Sigma公司)；丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDHL）试剂盒（北京中生北控生物科技股份有限公司）；单胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）、丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）、谷胱甘肽S转移酶（glutathione stransferase，GSHST）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor，TNFα）、白细胞介素6（interleukin 6，IL6）、白细胞介素8（interleukin 8， IL8）试剂盒（北京北方生物技术研究所）；Raabit antiCD14，Raabit antiTNFα（武汉博士德生物工程有限公司）；五灵胶囊（西京医院制剂室生产，批号：20020207）；1252型紫外分光光度计（日本岛津）；BB16/贺利气体培养箱（德国HERAEUS公司）.
1.2方法
1.2.1供试液的制备1640维持液：取灭活小牛血清10 mL加RPMI 1640 90 mL，即得；1640生长液：取灭活小牛血清20 mL加RPMI 1640 80 mL，即得；DMEM维持液：取灭活小牛血清10 mL加DMEM・F12 90 mL，即得；DMEM生长液：取灭活小牛血清20 mL加DMEM・F12 80 mL，即得；LPS贮备液：精密称取LPS 1.0 mg，加1640 DMEM维持液溶解至10 mL，微孔滤膜除菌，-20℃冷藏，备用；20 μg/L LPS供试液：取LPS贮备液加DMEM维持液稀释至20 μg/L，临用现配；60 μg/L LPS供试液：取LPS贮备液加混合液（肝细胞培养上清和1640维持液1∶1混合）稀释至60 μg/L，临用现配；0.5 mmol/L DGlaN供试液：精密称取DGlaN 5.38 mg，加DMEM维持液10 mL，微孔滤膜除菌，-20℃冷藏，用时加DMEM维持液稀释至50 mL；五灵胶囊供试液：取五灵胶囊内容物20 g，加乙醇150 mL回流提取1 h，滤过，减压回收乙醇，残渣加DMSO溶解制成1.0 kg/L（以药粉计）的贮备液，微孔滤膜除菌过滤（0.22~0.45 μm），用时取1.0 kg/L的贮备液加DMEM维持液稀释至终浓度为（4， 3， 2 g/L）为肝细胞受试药物；另取1 g/L的贮备液加1640维持液稀释至终浓度为（0.2， 0.1 g/L）为KC细胞受试药物.
1.2.2大鼠原代肝细胞分离与药效试验取12 wk龄大鼠3只，质量180 g，♂，乌拉坦2 mL麻醉(250 mg/L， ip)，按文献［4］操作制备原代肝细胞，肝细胞重悬于DMEM生长液中，调整细胞密度为2×108个细胞/L，接种于24孔培养板内，置37℃ 50 mL/L CO2孵箱内培养48 h后，吸弃培养液；加4，2 g/L浓度五灵胶囊与肝细胞培养32 h，台盼蓝拒染试验和MTT活性试验检测受试药物对细胞毒性的影响，台酚蓝拒染率&>95%、MTT检测肝细胞活性A490 nm 0.550～0.650，进行试验. ① 肝细胞修复试验：取培养板内细胞分为：正常组、DGlaN（或LPS），五灵胶囊4， 3和2 g/L组，正常组每孔加DMEM维持液；DGlaN， LPS 2种损伤组与五灵胶囊3个剂量组分别加0.5 mmol/L DGlaN， 20 μg/L LPS供试液培养24 h，每组每剂量，1 mL/孔(n=8)，吸弃培养上清；正常组、DGlaN与LPS 2种损伤组加DMEM维持液，五灵胶囊3个剂量组加相应的剂量供试液1 mL/孔，继续培养24 h，收集培养上清，测定ALT， MAO， LDHL， GSHST和MDA; ② 肝细胞保护试验：另取肝细胞置24孔板内培养、分组同上，正常组和DGlaN， LPS损伤组加DMEM维持液1 mL/孔，五灵胶囊3个剂量组加相应剂量供试液1 mL/孔，培养24 h，吸弃上清液，全部试验组经无血清DMEN培养液漂洗1次，吸弃洗涤液；正常组加 DMEM维持液，DGlaN， LPS损伤组与五灵胶囊3个剂量组分别加含有0.5 mmol/L DGlaN， 20 μg/L LPS供试液1 mL/孔，继续培养24 h，取上清液测定ALT， MAO， LDHL， GSHST和MDA.
1.2.3KC细胞分离与TNFα，IL6，IL8检测按冯俊明等［5］介绍方法，沉淀细胞用200 mL/L小牛血清培养液洗涤，3000 r/min离心10 min，2次；4 g/L台盼蓝拒染，调整细胞密度1×1011个/L后，接种于培养瓶内置37℃ 50 mL/L CO2孵箱内培养，经反复传代纯化后细胞用于试验. 取24孔培养板2块，每孔加入8 mm×8 mm玻片1张，每孔接种纯化KC悬液1 mL（每mL含细胞数约1×108个），置37℃ 50 mL/L CO2孵箱内培养使细胞长成单层，分组；正常组、模型组、五灵胶囊2个剂量组（200， 100 mg/L），每组8孔，正常组、模型组加1640维持液，五灵胶囊2个剂量组分别加入200， 100 mg/L 五灵胶囊供试液1 mL，继续培养24 h，弃除上清，正常组继续加1640维持液、模型组、五灵胶囊2个剂量组加含60 μg/L LPS供试液1 mL，继续培养12 h，收集各组细胞上清至-80℃保存，按TNFα， IL6， IL8试剂盒说明书项下操作测定含量. 在含小盖玻片的24孔板，取出小盖玻片，0.01 mol/L pH 7.4的PBS缓冲液洗涤2次，固定于预冷至4℃丙酮固定液中10 min，-20℃保存.
1.2.4HE与免疫细胞化学染色取KC玻片行HE染色，光镜观察细胞形态学；链霉菌抗生物素过氧化物酶免疫组化染色：对KC玻片分别与抗CD14（1∶100）、抗TNFα的mAb进行孵育，按试剂盒操作说明进行免疫组化反应，用二氨基联苯胺（DAB）0.3 mL/L h3O2系统显色10 min. 苏木素衬染、脱水透明后，中性树胶封片. 阴性对照用PBS取代一抗. 结果评定：标本中无明确阳性反应者为阴性，以-表示阳性表达，以+表示强度.
1.2.5诱生的细胞因子对肝细胞作用取1.4项下KC调整细胞密度1×1011个/L，置24孔板（n=3）内，37℃ 50 mL/L CO2孵箱内培养，待长至单层，吸弃上清，分组：正常组和细胞因子诱生组，正常组KC加1640维持液(n=8)；余下设细胞因子诱生组：KC加60 μg/L LPS供试液1 mL培养12 h，取上清备用；另取1.3项下肝细胞（24孔板）置吊篮内，4℃ 800 r/min离心15 min，弃除上清，分4组：正常组、细胞因子组、五灵胶囊200和100 mg/L组(n=8). 正常组与细胞因子组加DMEM维持液1 mL，五灵胶囊组加含200， 100 mg/L五灵胶囊供试液1 mL培养24 h后，4℃ 800 r/min离心15 min，吸弃上清液，正常组加正常KC培养上清，细胞因子组与五灵胶囊2个剂量组加细胞因子诱生组的KC培养上清1 mL/孔，继续培养24 h后取上清测定ALT， AST和LDHL酶活性.
统计学处理： 所测数据以x±s表示，采用SPSS 10.0统计软件，Tab 1， 2， 3， 4资料用KruskalWallis秩和检验分析，Tab 5，6资料用单因素方差分析.表1五灵胶囊对DGlaN诱导肝细胞损伤的修复作用（略）表2五灵胶囊对LPS诱导肝细胞损伤的修复作用（略）表3五灵胶囊对DGlaN诱导肝细胞损伤的保护作用（略）表4五灵胶囊对LPS诱导肝细胞损伤的保护作用（略）
2结果
2.1对DGlaN，LPS诱导肝细胞损伤的修复和保护作用五灵胶囊对肝细胞毒性试验 ，MTT检测活性与对照组肝细胞相似. 修复试验显示:0.5 mmol/L DGlaN， 20 μg/L LPS供试液导致肝细胞损伤，酶活性显著增高，2种模型组的酶活性高于正常组(P&<0.01). DGlaN损伤肝细胞模型试验显示五灵胶囊3 g/L组肝细胞酶活性低于模型组(P&<0.01)，而五灵胶囊2 g/L组仅使MAO和MDA水平降低(P&<0.01)：LPS损伤肝细胞模型试验显示五灵胶囊3 g/L能拮抗LPS所致肝细胞损伤（Tab 1，2）. 保护试验显示不同剂量的五灵胶囊与肝细胞培养24 h后，弃除培养上清，分别加0.5 mmol/L DGlaN， 20 μg/L LPS与肝细胞培养24 h，五灵胶囊4.0 g/L， 3.0 g/L均能拮抗DGlaN， LPS诱导的肝细胞损伤，作用与剂量相关（Tab 3，4）.
2.2对LPS诱导KC细胞分泌TNFα，IL6和IL8的影响模型组KC经LPS诱导后释放TNFα，IL8 水平明显地高于正常组（P&<0.05，Tab 5），IL6水平与正常组相似.五灵胶囊2个剂量对LPS诱导KC释放TNFα， IL8有显著抑制作用（P&<0.05， Tab 5）.表5五灵胶囊对LPS诱导KC细胞分泌TNFα，IL6，IL8的影响（略）
2.3对KC释放细胞因子导致肝细胞损伤的影响0.06 mg/L LPS供试液诱导KC释放细胞因子的培养上清，加入生长良好的肝细胞制备细胞因子组，上清中ALT， AST和LDHL酶活性与正常组比较有明显差异（P&<0.05）， KC释放细胞因子诱导肝细胞损伤，酶活性升高的幅度不同. 五灵胶囊可阻滞LPS诱导KC释放细胞因子导致肝细胞损伤， 肝细胞培养上清中ALT， AST酶活性明显地低于细胞因子组， LDHL活性显著高于模型组(Tab 6).表6五灵胶囊对LPS诱导KC释放的细胞因子对肝细胞损伤的影响（略）
2.4细胞形态与组化结果HE镜检：原代KC，核肾形或椭园形，核仁2~5枚，核膜清晰，胞质丰富，分裂相易见，并伴有大颗粒淋巴细胞. LPS诱导KC，核大致正常，少数胞核固缩、边集、胞体缩小，胞质嗜酸性性变及空泡样改变，缩小KC聚集成团或岛状，分裂相和大颗粒淋巴细胞明显减少. 五灵胶囊对未经LPS诱导的KC组，其大颗粒淋巴细胞增加. 五灵胶囊200 μg对LPS诱导KC胞核形态与正常KC大致相同，胞质呈极性状，伴嗜酸性性变， 100 μg组KC胞核固缩及嗜酸性性变增多，胞质空泡化易见. 未见大颗粒淋巴细胞增加. 免疫组化染色显示：TNFα定位于胞质：正常KC胞质TNFα呈阳性染色（+）， LPS诱导KC胞质TNFα呈强阳性染色（）， 五灵胶囊2个剂量组KC胞质TNFα呈弱阳性染色；CD14定位于胞质及核膜：正常 KC胞质及核膜均呈弱阳性染色（+）， LPS组KC细胞呈强阳性染色（）， 五灵胶囊2个剂量组呈阳性染色.
体外证实五灵胶囊能阻止LPS，DGlaN导致肝细胞损伤的发生与恶变，与体内试验结果相似［3］，药物与HC，KC共同培养的细胞毒性试验结果: MTT活性与对照组HC相似，HC对五灵胶囊耐受浓度大于KC约10倍，而对毒剂耐受能力较KC低数倍，浓度梯度试验选择肝细胞用药量为4 g/L，KC用药量为200 mg/L，采用药物与靶细胞共同培养一定时间，然后弃除含药培养上清，进行修复与保护作用试验，排除中药复方引起细胞毒性干扰体外试验结果. 结果说明五灵胶囊治疗慢性肝损伤作用及有效抑制肝细胞膜脂质氧化，增加膜的稳定性，促进肝细胞蛋白合成，可能是阻滞细胞因子诱导肝细胞损伤. 研究表明肝损伤的发生与发展与KC释放细胞因子密切关系，受外源或内源性LPS激活KC释放细胞因子是重要环节［6］. 结果显示：体外培养KC经0.06 mg/L LPS诱导12 h，KC释放TNFα，IL8较正常KC明显增加，对IL6无影响，另用0.02~0.1 mg/L LPS诱导KC释放细胞因子， 未见IL6水平随LPS浓度增加而增加，这点与文献报道不符［7］，这与试验方法和细胞培养环境有关. 五灵胶囊作用KC 24 h，离心，弃净上清，再加LPS诱导，五灵胶囊2个剂量在本试验条件下明显地抑制KC释放TNFα， IL8，对IL6无影响. 免疫组化TNFα， CD14结果显示: TNFα在LPS诱导KC浆表达显强阳性，CD14在LPS诱导KC胞质和核膜显强阳性表达， TNFα， CD14在药物试验各组对LPS诱导KC表达显弱阳性. 研究表明［8］ LPS(&<10 μg/L)低浓度激活KC是通过CD14完成的， 而高浓度LPS并非如此，说明LPS介导KC激活有CD14依赖和非依赖途径，这与释放不同因子有关，但TNFα产生是依赖CD14，试验组呈阳性表达证实上述细胞因子分析结果可靠性. HE染色镜检经LPS诱导KC部分细胞损伤，此损伤并不影响所测因子的释放，受试药物对靶细胞无毒性反应，是LPS导致衰老细胞或处于分裂细胞的死亡相关. 五灵胶囊抑制KC表达CD14下调细胞因子是治疗慢性肝炎的作用机制之一. 研究表明:60 μg/L LPS诱导KC后产生的细胞因子加入同时培养肝细胞内并观察肝细胞酶的变化， 60 μg/L LPS刺激KC模型组TNFα， IL8显著增加， 肝细胞上清酶ALT， AST活性也明显地增加， LDHL活性降低，说明LPS刺激KC释放细胞因子能使肝细胞受损. 当五灵胶囊加入肝细胞培养24 h，然后弃除培养上清，加入60 μg/L LPS刺激KC产生的细胞因子培养相同时间， 肝细胞上清酶ALT， AST活性也明显地降低， LDHL活性提高，提示五灵胶囊能有效地阻滞KC释放细胞因子对肝细胞损害，证实上述试验结果.该试验的KC和肝细胞选择非常重要，肝细胞上清酶ALT， AST， LDHL释放与肝细胞培养时间和细胞所处的培养环境有关，肝细胞培养时间过长对细胞因子敏感下降.所测酶的数据不稳定， KC应在10代内，反复传代可使KC功能减弱，以导致肝细胞损伤使试验失败.
参考文献
［1］ 金珍婧，李东复，太金华，等. 慢性肝病患者血清细胞因子变化与临床意义［J］. 中国免疫学杂志，2000；16(7):390-391.
Jin ZJ， Li DF， Tai JH， et al. Study on relationship among cytokine level change in the sera of patients with chronic viral hepatic disease， viral replication and clinical significance［J］. Chin J Immunol，2000；16（7）：390-391.
［2］ 孙利， 周永新，连建奇. 五灵胶囊治疗慢性肝炎的临床随访观察［J］. 第四军医大学学报，2000；21(7):905-906.
Sun L， Zhou YX， Lian JQ. The followup study on effect of the chronic viral hepatitis treated with WuLing capsules［J］. J Fourth Mil Med Univ， 2000；21（7）：905-906.
［3］ 王胜春，胡咏武，李剑峰，等. 五灵胶囊对小鼠免疫功能的影响［J］. 第四军医大学学报，2002；23(16):1518-1521.
Wang SC， Hu YW， Li JF， et al. Effects of Chinese drug WuLing capsule on immune function in mice.［J］. J Fourth Mil Med Univ，2002；23（16）：1518-1521.
［4］ 淡冶雄，李万亥，姚真真，等. 依布硒啉对四氯化碳内毒素+D氨基半乳糖致肝损伤的保护作用［J］. 药学学报，1999；34（2）：99-101.
Dan YX， Li WH， Yao ZZ， et al. Protection of Ebselen on liver damage induced by CCL4 and lipopolysaccharides+DGlaN actosamine in vivo and in vitro［J］. ACTA Pharmac Sin， 1999；34（2）：99-101.
［5］ 冯俊明，史景泉，刘友生，等. 大鼠肝脏枯否细胞分离、培养与鉴定［J］. 第三军医大学学报，2002；24(2):223-224.
Feng JM， Shi JQ， Liu YS， et al. Isolation， culture and identification of Kupffer cells from rat liver［J］. Acta Acad Med Mil Tert， 2002；24(2)：223-224.
［6］ 刘立新，韩德五. 不同剂量内毒素刺激库否细胞分泌肿瘤坏死因子ａ内皮素1的体外观察［J］. 中国病理生理杂志，2000；16(12):1298-1300.
Liu LX， Han DW. Lipopolysaccharide stimulates TNFａ and endothelin1 secretion from cultured rat Kupffer cell［J］. Chin J PathoPhysiol， 2000；16(12)：1298-1300.
［7］ 刘立，麦合昌，徐国良. 中药复方降酶合剂对大鼠肝脏因子调节的实验研究［J］. 第一军医大学学报，2001；21（5）:345-347.
Liu L， Mai HC， Xu GL， et al. Adjusting effect of Jiangmeiheji on cytokines of rat liver［J］. J First Mil Med Univ， 2001；21(5)：345-347.
［8］ 冯俊明，刘友生，史景泉，等. CD14的表达及其在枯否氏细胞激活的意义［J］. 中华烧伤杂志， 2002；18(2):107-110.