作者：徐强，王枫，李等松，陈长生，徐文，缪珊
【关键词】 人口腔上皮癌细胞株
【Abstract】 AIM: To study the mechanism of apoptosis of KB cells induced by Topotecan (TPT). METHODS: MTT assay was applied to test the proliferation arrest of KB cells under the treatment of TPT for 12， 24 and 48 h， agarose gel electrophoresis of genomic DNA and flow cytometry (FCM) were used to examine the apoptosis of TPTtreated KB cells and Westernblot was used to test the phosphorylations of p38MAPK proteins. RESULTS: The inhibition ratio of TPTtreated KB cells for 12， 24 and 48 h was (24.4±9.1)%， (33.7±6.6)% and (45.1±10.4)%， respectively， with significant difference between different treatment duration (P&<0.05). By FCM， the apoptosis rate of the cells was (11.5±2.8)% at 12h and (31.2±4.1)% at 24 h， with significant difference (P&<0.01). Agarose gel electrophoresis of genomic DNA of TPTtreated KB cells for 12 h showed DNA fragmentations， typical index of apoptosis in biochemistry. The phosphorylations of p38 increased gradually with the prolongation of TPT treatment (12， 24 and 48 h) (n=3， P&<0.05). CONCLUSION: TPTinduced apoptosis of KB cells in vitro may result from the enhanced activation of p38MAPK.
【Keywords】 TPT(Topotecan); KB cells; phosphorylated protein38; apoptosis
【摘要】 目的： 研究拓扑特肯(Topotecan， TPT)诱导体外培养的人口腔上皮癌细胞(KB)凋亡的作用及其可能机制. 方法： 体外培养KB细胞，加30 mg/L的TPT孵育12， 24和48 h，用MTT 法检测TPT 对KB细胞增殖的作用； DNA凝胶电泳和流式细胞仪技术检测TPT 诱导KB细胞凋亡，Westernblot检测pp38MAPK的表达. 结果: TPT处理细胞12， 24和48 h后，KB 细胞的抑制率分别为(24±9)%， (34±7)%和(45±10)%，各组间有显著性差异(P&<0.05)；流式细胞仪检测其凋亡率，12 h时(11.5±2.8)%， 24 h( 31.2±4.1)%，各组间有显著性差异(P&<0.01)；DNA凝胶电泳可见TPT作用12 h组DNA碎片化，是典型的细胞凋亡生化指标；TPT处理细胞12， 24和48 h后，KB细胞的pp38MAPK表达逐渐升高(n=3， P&<0.05). 结论: TPT可通过pp38MAPK开放表达信号通路诱导体外培养的TPT 处理KB细胞凋亡.
【关键词】 拓扑特肯；人口腔上皮癌细胞株；磷酸化的丝裂原活化蛋白激酶38；凋亡
0引言
拓扑特肯(Topotecan， TPT)为9二甲基氨基10羟基喜树，是近年来临床上用于治疗晚期肺癌的新型化疗药物，在美国已被批准用于晚期难治性卵巢癌［1］. 目前国内对TPT的研究报道较少，其抗肿瘤作用机制尚未明确. 丝裂原活化的蛋白激酶（MAPKs）在将细胞外刺激信号转导至细胞及核内的过程中，通过丝/苏/酪氨酸磷酸化，参与细胞增殖、分化、转化及凋亡等及其重要的生物学反应，其中p38 MAPKs主要参与细胞凋亡相关的调控［2］. 本实验我们观察了TPT对体外培养KB细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用，并研究了MAPK信号转导通路pp38的表达，以初步探讨其诱导KB细胞凋亡的机制，为人口腔上皮癌的治疗提供依据.
1材料和方法
1.1材料
Topotecan购自Gene公司，RPMI 1640购自Gibco公司，KB细胞购自上海细胞所，MTT购自Sigma公司，p38一抗、二抗和pp38一抗、二抗及标准分子量蛋白Marker均购自美国Santa Cruz公司，化学荧光显迹液化学荧光发光剂购自美国Pierce公司，预染标准分子质量蛋白Marker购自美国BioRad公司；IMAGINGQUANT数据处理系统由提供.
1.2方法
1.2.1MTT实验检测Topotecan对KB细胞毒作用用含小牛血清100 mL/L，青霉素100 u/L，链霉素100 mg/L的RPMI 1640培养基在37℃， 50 mL/L CO2培养箱中培养KB细胞. 0.25 mg/L胰酶消化贴壁KB细胞， 细胞密度为1×107个/L，于96孔培养板内接种100 μL/孔(约800个细胞)，培养24 h. 设对照组，给药组加入含有Topotecan 25 mg/L的RPMI1640培养基，每孔100 μL，平行8个孔，孵育12， 24和48 h后弃去培养液，每孔加入200 μL浓度2 g/L MTT培养液培养4 h，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，轻度振荡，酶标仪在490 nm条件下测定A值，用空白组调零. 细胞抑制率用下式计算.
细胞抑制率（%）=A对照组-A实验组〖〗A对照组×100%
1.2.2WesternBlot测定蛋白磷酸化水平［3］样品处理： 裂解细胞，分离提取蛋白. 根据MTT实验结果选取含有Topotecan 25 mg/L的RPMI 1640培养液培养KB细胞12， 24和48 h后，用冷的PBS洗2次（pH 7.4），加入适量预冷的细胞裂解液（Tris HCl l50 mmol/L， pH 7.4， 10 g/L NP40， 1 mmol/L EDTA， 1 mmol/L Na3VO3， 1 mmol/L NaF， 100 mg/L PMSF， 40 ml/L蛋白酶抑制剂），冰浴15 min，用吸管将细胞碎片连同细胞裂解缓冲液一起转移至经冷却的Eppendorf离心管中；4℃以15 000 g将裂解物离心10 min，收集上清液，加入SDS加样缓冲液（100 mmol/L TrisHCl pH 6.8， 200 mmol/L DTT， 40 g/L SDS， 2 g/L溴酚蓝，200 mg/L甘油），沸水浴煮5 min，将样品进行分装，保存于-80℃. 蛋白质定量分析： 用改进的Folin酚法定量蛋白. WesternBlot测定蛋白磷酸化水平.
统计学处理： 实验数据用x±s表示，组间差异比较用SPSS软件进行非参秩和检验，P&<0.05表示有统计学意义.
2结果
2．1不同浓度Topotecan对KB细胞增殖的抑制作用25 mg/L TPT 处理细胞12， 24和48 h后，KB细胞的抑制率分别为(24±9)%， (34±7)%和(45±10)%，与对照相比差异显著(P&<0.05)，各组间差异亦有显著性(P&<0.05).
2.2流式细胞仪检测25 mg/L TPT处理细胞12， 24 h后凋亡率分别为(19.4±2.8)%和(30.1±4.1)%，与对照组比较差异显著(P&<0.05， Fig 1~3).
2.3DNA凝胶电泳25 mg/L TPT处理细胞12 h后，可见KB细胞DNA碎片化，是典型的细胞凋亡生化指标（Fig 4）.
2.4Topotecan作用下KB细胞pp38MAPK的表达25 mg/L TPT处理细胞12， 24和48 h后，KB细胞的pp38MAPK表达分别为21.5%， 48.8%和83.1%，逐渐升高. 作用48 h时其磷酸化水平比对照pp38MAPK10.8%增加了7.6倍(n=3， Fig 5）.
3讨论
人口腔上皮癌是一种死亡率较高的恶性肿瘤，对人类健康的危害日益严重. 近年来， 人口腔上皮癌的发病率和死亡率呈上升趋势. 在我国往往早期发现者较少，目前临床上对人口腔上皮癌多采取手术治疗加化疗，寻找有效的化疗药物，成为目前肺癌治疗的关键.
喜树碱是从植物喜树树皮中提取出来的一种五环生物碱. 其抗肿瘤活性与抑制Topo Ⅰ的作用有关［4］. 已知Topo Ⅰ在DNA的复制转录和重组中均起重要的作用，喜树碱类化合物能抑制Topo Ⅰ的活性，使DNA单链断裂，抑制DNA 复制，发挥独特的抗癌作用［5］. 因此人们一直致力于寻找高效低毒的喜树碱衍生物，其中新型的喜树碱衍生物TPT 就是其中之一. TPT 在临床化疗中显示了较好的效果，有望成为治疗中晚期人口腔上皮癌的主要药物之一［6］. 但是目前对于TPT治疗人口腔上皮癌的作用机制尚无报道. 过去一般认为，化疗药物杀伤癌细胞的主要机制是通过损伤DNA的基因毒性引起癌细胞坏死［7］，近几年，随着对细胞凋亡现象的进一步认识及其发生机制的研究，人们逐渐认识到大多数化疗药物具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，而这可能是其作用的主要机制［8］. 为了进一步明确TPT 的作用及机制，本实验在体外观察了TPT 对KB细胞株的增殖抑制作用及诱导细胞凋亡的作用. 实验结果表明，TPT 对KB细胞增殖有较强的抑制作用，随着作用时间的延长， 人口腔上皮癌细胞存活率显著降低； DNA凝胶电泳显示 25 mg/L TPT处理细胞12 h后，可见KB细胞DNA碎片化，是典型的细胞凋亡生化指标；流式细胞仪检测到明显的凋亡峰，且KB细胞凋亡率随着TPT 作用细胞的时间延长而升高. 25 mg/L TPT处理细胞12， 24和48 h后，KB细胞的pp38MAPK表达明显升高(P&<0.05). 作用48 h时其磷酸化水平比对照增加了7.6倍(n=3)，与流式细胞仪测定结果显示出一致性. 表明TPT 可直接作用于KB细胞抑制其增殖，并诱导KB细胞凋亡. 因此TPT可能通过pp38MAPK开放表达信号通路诱导体外培养的TPT 处理KB细胞凋亡.
【
参考文献
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