作者：张晓慧，徐海峰，张金赫
【关键词】 血管抑素
【关键词】 血管抑素;亲和层析法
0引言
血管抑素(angiostatin，AS)是肿瘤源性血管生成抑制因子，相对分子质量(Mr) 38 000［1］. AS包括纤溶酶原(plasminogen， Pgn)的前四个Kringle结构，每个Kringle上均有特异的赖氨酸结合位点，因此可利用亲和层析的方法从血浆中提取AS.
1血管抑素的制备
［2］取200 mL新鲜血浆用蒸馏水做两倍体积稀释，双层滤纸过滤. 取滤后血浆缓慢加入至准备好的Lysine Sepharose4B的亲和层析柱上，用恒流泵控制流速0.5 mL/min；以5~8倍柱床体积pH为7.4的0.3 mol/L磷酸缓冲液洗去杂蛋白；再以两倍柱床体积pH为7.4的0.1 mol/L磷酸缓冲液洗涤；加入16.67 nkat的弹性蛋白酶，用吸管将层析介质悬起，室温酶切8~10 h；再以5~8倍柱床体积pH为7.4的0.3 mol/L磷酸缓冲液洗涤. 最后用0.2 mol/L 6氨基己酸洗脱，洗脱速度0.5 mL/min，收集目标蛋白峰，SDSPAGE鉴定.
2结果和讨论
本试验在室温下对弹性蛋白酶取不同的浓度、酶切时间和血浆流速，用正交设计的方法，得出本实验AS的最佳制备条件为弹性蛋白酶16.67 nkat，室温酶切8~10 h，血浆流速不超过40 mL/h. 所制备的AS经SDSPAGE鉴定，与文献报道一致.
实验中关键是要掌握好弹性蛋白酶的浓度及酶切时间. 本试验中，弹性蛋白酶25.00 nkat，酶切时间超过12 h，纤溶酶原会被过度切割，产生若干种片段，分子量偏小，Mr约为20 000左右；时间过短，纤溶酶原又不能被充分切开. 其次，血浆流速要适中，不要超过40 mL/h，太快会导致纤溶酶原与层析柱不能充分结合或结合不够牢固，致使AS产量偏低；另外还要注意抑制杂菌生长，延长层析柱的使用寿命. 目前， AS已进入临床试验，有可能成为一种有效的抗肿瘤药物［3］.
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参考文献
】［1］ O’Reilly MS， Holmgren L， Shing Y， et al. Angiostatin: A novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a lewis lung carcinoma［J］. Cell， 1994;79(2):185-188.
［2］ 李福洋. 一步法从血浆中制备血管生成抑制素［J］. 第四军医大学学报，1999;20(2):75-78.
［3］ Kirsch M， Santarius T， Black PM， et al. Therapeutic antiangiogenesis for malignant brain tumors［J］. Oncology， 2001;24(5):423-430.转贴于