作者：宋颖芳，李焕章，苏明权，吴昌归
【关键词】 ，血小板活化因子
【Abstract】 AIM: To investigate the effects of plateletactivating factor (PAF) on the proliferation of rat airway smooth muscle cells （ASMCs） and the expression of nuclear factorκB (NFκB). METHODS: MTT assay and flow cytometry were used to analyze the effects of PAF on the proliferation of ASMCs in vitro and NFκB activity change of the ASMCs stimulated by PAF was examined by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). The effects of Nacetylcysteine (NAC) on the function of PAF were also studied. RESULTS: PAF (1×10-6-1×10-9 mol/L) stimulated the cell proliferation and reached its maximal effect at 1×10-7 mol/L. The proliferative index (PI) of the ASMCs significantly increased（P&<0.05）and the NFκB activity was enhanced obviously（P&<0.01） following stimulation of PAF (10-7 mol/L). NAC (20 mmol/L) partly inhibited the cell proliferation and the increased NFκB activity induced by PAF （P&<0.05）. CONCLUSION: PAF can stimulate the proliferation of ASMCs， which may be achieved partly through the activation of NFκB pathway.
【Keywords】 plateletactivating factor；airway; smooth muscle cell；nuclear factorκB
【摘要】 目的：观察血小板活化因子(PAF)对离体培养的大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)的增殖及其核转录因子NFκB蛋白表达的影响. 方法：MTT法及流式细胞仪检测细胞周期，EMSA法检测PAF刺激后ASMCs中NFκB的活性改变；观察N乙酰半胱氨酸（NAC）干预对PAF作用的影响. 结果：PAF在1×10-6～1×10-9 mol/L范围内均能促进ASMCs的增殖(P&<0.01)，且1×10-7 mol/L时增殖作用最强， ASMCs细胞增殖指数明显增高（P&<0.05），同时ASMCs细胞核内NFκB活性明显增加（P&<0.01）. 预先用20 mmol/L NAC干预后，PAF的促增殖作用及核内NFκB活性均被明显抑制，但该抑制作用呈不完全抑制（P&<0.05）. 结论：PAF能促进ASMCs的增殖，这一作用部分是通过激活NFκB通路而发挥的.
【关键词】 血小板活化因子；气道;平滑肌细胞；核因子NFκB
0引言
血小板活化因子(PAF)是一种强效的内源性磷脂类介质，对气道和肺血管功能起重要的调节作用，参与气道慢性炎症、肺动脉高压、气道高反应性、急性肺损伤等多种呼吸系统疾病的发生发展过程. 近来研究发现PAF是NFκB激活的最直接、最近端的关键性调节剂［1］，直接参与NFκB的活化. NFκB在调节IL6，TNFα等炎性基因的表达及细胞增殖、凋亡中起重要的作用. 但PAF对NFκB的活化是否与其对气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖的影响作用有关，尚需探讨. 为此，我们检测了PAF对ASMCs增殖的影响及PAF刺激后ASMCs的NFκB活性改变.
1材料和方法
1.1材料
MTT，PAF，NAC（N乙酰半胱氨酸）、胰蛋白酶（Sigma公司）；Ⅳ型胶原酶、DMEM（Gibco公司）；胎牛血清（FCS，杭州四季青生物公司）；NEPERTM 试剂盒（美国Pierce公司）；Gel Shift Assay试剂盒（美国Promega公司）；γ32P ATP（北京亚辉生物医学工程公司）； SD大鼠1只，雄性，体质量90 g（第四军医大学实验动物中心）. 流式细胞仪EPICS XL（Coulter公司）.
1.2方法
1.2.1大鼠ASMCs培养及鉴定参照文献［2］的消化培养法获得. 培养的ASMCs以形态特征及其抗αactin mAb对ASMCs进行免疫组化SABC法染色鉴定. 取5～10代细胞（细胞纯度＞95％）用于实验.
1.2.2MTT法检测不同条件下的ASMCs增殖活性取对数生长期ASMCs以7×103/孔接种于96孔培养板内，各浓度设8个复孔，37℃，50 mL/L CO2孵箱内孵育12 h使细胞贴壁，弃上清液，无血清DMEM液同步化24 h后，将细胞分为3组，即PAF组、NAC组和对照组. PAF组加入含PAF及5 mL/L FCS的DMEM液，使PAF终浓度分别为1×10-6，1×10-7，1×10-8和1×10-9 mol/L；NAC组在同步化2.5 h时换用含20 mmol/L NAC的DMEM液继续同步化21.5 h，而后分别加入上述不同浓度的PAF，37℃，50 mL/L孵箱培养48 h，再每孔加入MTT液20 μL，继续培养4 h后，弃上清，加入二甲基亚砜(DMSO) 150 μL振荡10 min，酶联免疫检测仪测定各孔A492 nm，并确定PAF作用的最佳浓度；对照组仅加入含5 mL/L FCS的DMEM液.
1.2.3流式细胞仪检测不同条件下ASMCs增殖指数的改变将新传代的ASMCs接种于100 mL培养瓶内，用上述方法对各组ASMCs进行同步化处理后，PAF，NAC组均加入含1×10-7 mol/L PAF及含5 mL/L FCS的DMEM液，对照组仅加入含5 mL/L FCS的DMEM液，孵育36 h后收获各组细胞，配成细胞密度为1×106/L的悬液，碘化吡啶染色，4℃避光放置30 min，过300目滤网，用流式细胞仪进行细胞周期分析（各浓度组重复3次），并计算细胞增殖指数(PI)，PI=(S+G2/M)/(G0/1+S+G2/M)×100%
1.2.4ASMCs中NFκB活性的检测
1.2.4.1ASMCs细胞核蛋白的提取将新传代的ASMCs接种于100 mL培养瓶内，对照组及PAF组用含5 mL/L FCS的DMEM液培养，待细胞汇合近瓶底面积的60％时，NAC组换用含NAC 20 mmol/L及5 mL/L FCS的DMEM液培养21.5 h，而后将1×10-7 mol/L的PAF同时加入PAF组及NAC组，分别于0.5，1，2和4 h收集细胞（1×106）. 使用NEPERTM试剂盒提取AMSC的核蛋白，分装并于-70℃保存. Branford法进行核蛋白浓度检测.
1.2.4.2EMSA法检测NFκB的活性按Promega公司的Gel Shift Assay Systems试剂盒提供的说明书进行. NFκB寡核苷酸探针序列为：5′AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC3′(P1)， 3′TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG5′（P2），采用T4寡核苷酸激酶法标记探针，游离探针用乙醇纯化法除去. 而后继续使用该试剂盒进行DNA结合反应，每一胶板同时用一道标准品做对照，此标准品为用试剂盒提供的HeLa细胞核提取物与γ32P标记的SP1探针结合反应而成. 行50 g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（150 V，20 min），干胶1 h；-70℃放射自显影48 h. 用凝胶图像分析系统(密度扫描仪)对显影胶片进行扫描，以各样品与标准品电泳滞后带的A492 nm值表示NFκB的活性.
1.2.4.3特异性及非特异性竞争试验取1×10-7 mol/L PAF组1 h的核蛋白2 μg，按上述方法，在加入NFκB标记探针前加入未标记NFκB探针1 μL (1.75 μmol/L)或未标记的无关探针（SP1， 1.75 μmol/L） 1 μL，室温孵育15 min，加入标记探针. 电泳，放射自显影.
统计学处理：各组实验数据以x±s表示，组间比较采用SPSS 10.0软件进行. 当方差齐性时，用oneway ANOVA检验，同时用SNKq检验进行两两间比较；当方差不齐时，采用KruskalWallis H检验.
2结果
2.1ASMCs生物学特性倒置光学显微镜下贴壁的气道平滑肌细胞呈长梭条形，细胞间互相交错排列呈网状、旋涡状或栅栏状，免疫组化染色显示抗αactin mAb呈阳性染色，主要分布于细胞质.
2.2MTT法检测PAF对ASMCs有明显的促增殖作用（P＜0.01，n=8），其中1×10-7 mol/L的PAF对ASMCs的作用最明显，其A492 nm是对照组的2.16倍［（0.186±0.002） vs (0.085±0.002)，n=8，P&<0.01］；NAC组A492 nm为(0.105±0.002)，介于PAF组及对照组之间（Fig 1）.
2.3PAF，NAC对ASMCs细胞周期的影响1×10-7 mol/L PAF处理ASMCs 36 h后，ASMCs的S及G2+M期细胞百分比均显著高于其他两组（P&<0.05），而预先用NAC干预后，细胞PI较PAF组明显下降，但仍高于对照组（P&<0.05，Tab 1）.表1PAF及NAC作用36 h对ASMCs细胞周期的影响（略） h
3讨论
慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease， COPD)是多种致病因素（理化性损伤、吸入毒性颗粒、微生物感染等）引起的以气道非特异性炎症反应和慢性气流阻塞为特征的一类疾病. 作为强效的磷脂类炎性介质，PAF在COPD的发生发展过程中发挥的重要作用日益受到广泛的关注，现已明确它能通过对血小板和中性粒细胞的趋化作用、参与呼吸爆发、氧自由基的释放、调节TIMP1与MMP1间的平衡等多种途径广泛参与COPD的慢性炎性反应［3］. 气道重建是COPD另一重要病理特征，ASMCs的过度增殖起着决定性的作用.本实验探讨研究PAF对ASMCs增殖的影响，结果显示PAF对ASMCs具有显著的促增殖作用，进一步证明在COPD的发生发展中具有重要作用:PAF不仅具有强有效的致炎作用，还能明显促进ASMCs增殖，同时参与COPD的两大重要病理特征的发生过程，它为PAF抑制剂在COPD治疗上的运用提供了理论依据.
近年的研究指出NFκB与COPD关系密切，COPD患者NFκB水平明显升高［4］. NFκB的靶基因主要是与免疫反应、应激反应、细胞增殖及凋亡相关的基因，它不但能诱发IL6和TNFα等多种炎性介质的表达，且能促进细胞增殖，抑制凋亡［5］. PAF是NFκB激活的最直接最近端的关键性调节剂［1］. 实验运用经典的EMSA法，再次证实PAF刺激ASMCs后，NFκB能被明显活化；结合MTT检测结果，不难发现PAF对细胞的促增殖作用与其对NFκB活性的影响呈同向性变化；从流式细胞仪的测定结果可见，PAF促进ASMCs的增殖主要是促进G0/G1期细胞向S和G2期转化，这一转化的限速因子细胞周期素D1（CyclineD1）的启动子含有NFκB结合序列，其表达受NFκB调控［6］，用NAC预处理后，NFκB活化受限，使细胞周期素D1表达降低，故而造成上述细胞周期的转化明显减弱，导致了PAF增殖作用的显著减弱，由此证实了NFκB信号途径的激活参与了PAF对ASMCs的促增殖作用. NFκB的激活能促进IL1β， TNFα等炎性因子及cfos， cjun的表达，导致ASMCs的增殖；趋化因子CX3CL1（Fractalkine）的表达也呈NFκB依赖性［7］，NFκB的激活也使其表达显著增强， Chandrasekar等［8］证实平滑肌细胞表达它的特异性受体CX3CR1，Fractalkine通过自分泌形式在SMC增殖中亦发挥着重要的作用.
实验中不难发现NAC对PAF的促增殖效应呈不完全抑制作用，且其在PAF对ASMCs的NFκB活化作用中也呈现不完全抑制作用，这些提示NFκB信号途径仅是PAF促进ASMCs增殖的通路之一. 此外，PAF与ASMCs上的PAF特异性受体结合后能激活磷脂酰肌醇、钙信使系统，产生大量的二酯酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇（IP3），后者在ASMCs的增殖中所发挥的重要作用已被广泛公认，这是另一条已明确的PAF促ASMCs增殖的通路. 但至今PAF促细胞增殖的机制尚未完全清楚，仍需进一步深入探讨.
【参考文献】
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