作者：郭卉，南克俊，阮之平，景昭，刘陕西
【关键词】 原发性肝癌
【Abstract】 AIM: To investigate the expression of p57kip2 and its relationship with clinicopathology， PCNA and p53 in primary hepatocellular carcinoma (HCC). METHODS: Expression of p57kip2， PCNA and p53 in tumor tissues from 32 patients with HCC and 10 liver tissues of normal persons was detected with Elivision immunohistochemical technique. RESULTS: p57kip2 protein positiveexpression rate in HCC was 56.2%，which was lower than that in normal tissues (100%) (P=0.011). The reduced expression of p57kip2 protein correlated significantly with moderate or lowdifferentiation of tumor cells (P=0.007)， high clinical stage (P=0.041) and poor prognosis (P=0.036)， but did not correlate significantly with metastasis， tumor size， level of AFP and age (P&>0.05). PCNA positiveexpression rate was 56.2%， which was correlated significantly with the expression of p57kip2 (P=0.036) and p53 positiveexpression rate was 46.9%， which was not correlated significantly with the expression of p57kip2 (P&>0.05). CONCLUSION: There is a marked loss or absence of p57kip2 expression and high expression of PCNA in HCC， which are involved in the carcinogenesis and development of HCC. p57kip2 and p53 may induce apoptosis via different mechanisms.
【Keywords】 p57kip2 gene; HCC; PCNA; p53
【摘要】 目的：检测细胞周期抑制因子p57kip2在肝癌中的表达水平，探讨它与临床病理因素、增殖细胞核抗原（PCNA）、p53的关系. 方法：用免疫组织化学法检测32例肝癌组织和10例正常肝脏组织中p57kip2， PCNA和p53的表达水平. 结果：p57kip2在肝癌组织中的阳性率56.2%，显著低于正常肝脏组织（100%）（P=0.011），p57kip2的缺失表达与肝癌细胞的分化较差(P=0.007)、临床分期较晚(P=0.041)及预后较差有关(P=0.036)，与年龄、AFP， 肿瘤大小及肿瘤侵犯转移无显著相关（P&>0.05）；PCNA在肝癌组织中阳性率为56.2%，与p57kip2的表达有关(P=0.036)；p53在肝癌组织中的阳性率46.9%，与p57kip2表达在统计学上无相关性（P&>0.05）. 结论：肝癌组织中存在p57kip2的表达缺失、PCNA的高表达， 共同参与肝癌的发生、发展，而p57kip2和p53可能通过不同途径来诱导细胞凋亡.
【关键词】 p57kip2基因；原发性肝癌；增殖细胞核抗原；p53
0引言
细胞周期机制破坏是导致肿瘤发生、发展的核心机制. p57kip2基因最早由Matsuoka等［1］发现，定位于染色体11p11.5，属于CIPKIP基因家族. 在结构上与p21、p27有部分同源性，通过抑制多种CDK活性从而使细胞俘获在G1期. 具有抑癌基因的活性［1］. 增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）的表达与细胞增殖状态密切相关［2］. p53是诱导细胞凋亡的重要基因，可间接反映细胞的凋亡情况［3］. 本试验旨在探讨p57kip2在肝癌组织中的表达缺失情况及它与临床病理因素、PCNA和p53的关系.
1材料和方法
1.1材料
1.1.1标本西安交通大学第一临床医院2000/2002手术切除的肝癌标本32(男26，女6)例. 全组患者年龄26~72（49.2±12.3）岁， 所有患者术前未经过化疗和放疗. 组织学分级32例中Ⅰ级3例，Ⅱ级14例，Ⅲ级11例，Ⅵ级 4例；TNM分期，Ⅰ期2例，Ⅱ期16例，Ⅲ期10例，Ⅳ期4例. AFP阳性15例. 所有病例均经病理学证实. 所有标本经40 g/L甲醛固定，石蜡包埋，4 μm切片，应用多聚赖氨酸包被，用作免疫组化研究 . 对所有蜡块HE染色观察，选出组织学形态较好的切片进行研究. 收集同时期意外死亡健康成年男性正常肝脏组织标本10例，经HE染色诊断为正常肝组织，作为对照组.
1.1.2试剂抗鼠抗人p57kip2 mAb（57P06），抗鼠抗人PCNA mAb（PC10），抗鼠抗人p53抗体（MAB0226），Elivision二步法检测试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司.
1．2方法
1.2.1p57kip2，PCNA，p53应用免疫组化(Elivision法)染色切片常规脱蜡至水，30 mL/L双氧水阻断内源性过氧化物酶20 min，将切片至于pH 6.0的柠檬酸缓冲液行高温高压抗原热修复7 min，置冷，羊血清封闭37℃孵育20 min. 加p57kip2一抗（1∶50），置于湿盒，4℃冰箱过夜. PCNA和p53一抗均按1∶50稀释，置37℃恒温箱孵育1 h. 先后加Elivision二步法检测试剂盒中试剂A、B各50 μL，分别室温孵育40 min. DAB显色，苏木素衬染，盐酸乙醇分化，脱水透明后中性树胶封固. 光学显微镜下观察结果. 以正常肝组织作p57kip2和p53的阳性对照，以磷酸缓冲盐溶液(PBS)代替一抗作阴性对照. 以正常肝组织作PCNA的阴性对照.
1.2.2结果判定p57kip2蛋白以胞核或胞质染色为棕黄色颗粒为阳性. 阳性细胞百分比为计400倍显微镜下10个视野阳性细胞的平均数：0，&<10%；1，10%~25%；2，25%~50%；3，50%~75%;4，&>75%. 阳性强度以着色程度进行计分: 0，不着色；1，淡黄；2，棕黄；3，棕褐. 两分相乘: 0~2为阴性，3~5为弱阳性，6~8为阳性，9~12为强阳性. PCNA及p53以胞核染色为棕黄色颗粒&>50%为阳性细胞.
统计学处理： 所得数据应用SPSS 11.0统计软件包处理. 采用Fisher确切概率法及Spearman相关分析. P&<0.05认为有统计学意义.
2结果
2.1p57kip2的表达在32例原发性肝癌(HCC)组织中，p57kip2阳性表达18例，表达率56.25%，所有正常肝组织均为阳性表达（Fig 1），表达率为100%，肝癌组织p57kip2的表达率显著低于正常组织（P=0.011）. 表达p57kip2的高分化肝癌组织中，胞质和胞核呈棕黄色颗粒(Fig 2). p57kip2在低分化肝癌组织中，与周围阳性癌旁组织相比，癌灶阳性细胞着色浅，数量少，细胞排列不一，形态紊乱(Fig 3).
2.2p57kip2表达与肝癌的病理分级、临床分期、及生存期等的关系p57kip2表达与肝癌的病理分级、临床分期、及生存期有关，与年龄、AFP， 最大瘤径及肝被膜转移和局部侵犯无关. 32例分化程度不同的肝癌标本中，癌细胞分化越差，p57kip2蛋白的表达率越低. p57kip2蛋白在Ⅰ~Ⅱ级的阳性率（88.2%）显著
Ⅲ~Ⅳ级阳性率（20.0%， P=0.007）. p57kip2蛋白表达在早期HCC患者（72.2%）及生存期≥1 a的患者（78.6%）显著高于晚期HCC患者（35.7%， P=0.041）及生存期＜1 a患者（27.8%， P=0.036）. 以血清甲胎蛋白(AFP)≥400 μg/L为阳性标准，p57kip2蛋白在AFP阳性的HCC患者中表达率（36.4%）低于AFP阴性的HCC患者（66.7%），但统计学分析无显著性差异（P=0.142）. p57kip2蛋白与肿瘤大小、年龄、肝被膜转移和局部侵犯无统计学相关（P&>0.05， Tab 1）.表1p57kip2与肝癌各项病理指标之间的关系（略）
2.3PCNA和p53在肝癌组织中的表达癌巢中绝大多数癌细胞PCNA阳性，而癌旁组织阳性细胞数量很少（Fig 4）. p53在肝癌组织中的表达，阳性细胞核圆形，成棕黄色颗粒，大小不一（Fig 5）.
2.4肝癌组织中p57kip2和PCNA及与p53的表达的相关性PCNA与p57kip2的表达程度之间有显著负相关性(rs=-0.397， P=0.025， Tab 2)，而p53与p57kip2的表达程度之间无显著性相关(rs=0.197， P=0.279， Tab 2).表2p57kip2与PCNA，p53在原发性肝癌组织表达中的相关性（略）
3讨论
细胞周期G1期的调控是有多种细胞周期调控因子参与的复杂过程，细胞周期G1期调控异常与肿瘤的发生发展密切相关［4］.
p57kip2基因定位于染色体11P11.5，编码316个氨基酸残基的多肽，Mr 57 000. p57kip2基因的表达产物属于CIP/KIP家族与p21， p27部分同源，包含三个结构域：一个与CDK抑制物p21及p27同源的N末端区域；一个中央脯氨酸富集域及一个与p27相同的C末端区（QT域）. 脯氨酸富集域含有一些PAPA重复序列（脯氨酸丙氨酸残基组成），它们被认为可以介导特异的蛋白蛋白相互作用，从而实现p57kip2功能［5， 6］. 其抑癌机制是通过p57kip2蛋白与CyclinCDK复合物(ECDK2、D2CDK2和ACDK2)结合，阻滞细胞增生，从而使细胞周期停滞在G1期而实现的［7］. 在众多CDKIs中，只有p57kip2是胚胎形成所必需的，在增殖、运动、变形、分化等一系列复杂过程中都起重要作用［8］. p57kip2基因敲除的小鼠常出现脐疝、软骨软化缺陷、肾髓质发育不良、肾上腺皮质增生异常，肿瘤发生率增高；同时该类小鼠大多数在24 h死亡，仅有10%的小鼠存活，却呈现严重的生长迟缓，提示p57kip2可能参与了细胞增殖和启动细胞分化的作用［9］.
p57kip2基因在正常人类是被印记的，这是第一个用该机制调控的细胞周期调控蛋白. 在正常情况下，p57kip2基因的父源基因被印记，母源基因表达. 在一些肿瘤中存在p57kip2基因印记缺失（Lose of Imprint）或印记错误，导致基因表达下降，导致肿瘤的发生发展［10］. p57kip2作为肿瘤抑制因子和生长调控因子，它这种单个等位基因的表达方式增加了畸形和癌变的危险［11］. 现已证实p57kip2在食管癌、胃癌、大肠癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌、胰腺癌等肿瘤组织均有表达［12-14］，但p57kip2表达与肝癌的关系报道较少. 本试验结果表明，p57kip2在肝癌组织中的表达率明显低于正常肝组织，并与组织分级、临床分期及预后有关，提示p57kip2表达阴性者细胞增殖活性高，发展较快，预后较差. 证明了p57kip2有抑制肿瘤细胞增殖的作用.
p53是重要的凋亡活化基因. p53基因的突变，导致细胞周期监控机制的破坏，人类50%的肿瘤都是由于p53基因突变，使DNA监测点异常，导致肿瘤的发生发展［16］. 但DNA损伤的监测还存在非p53依赖机制［17］. 本结果表明，p53在肝癌组织中的表达率（46.9%）明显低于正常组织（80%）；p57kip2阳性的肝癌组织中，p53的阳性率也高，但p53与p57kip2的表达程度之间无显著性相关(P&>0.05). 这恰恰说明p57可能是通过p53非依赖性机制，直接与CDKCyclins复合物结合，抑制它们激活参与细胞的增殖和凋亡调控，而不是像p21那样通过p53p21CDKsCyclins途径阻滞细胞周期.
综上所述，p57kip2蛋白的缺失及PCNA的高表达有助于肝癌的发生、发展，而p57kip2与p53可能通过不同的途径发挥细胞周期调控作用.
【参考文献】
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