作者：许春梅，董卫国，余保平，罗和生，于皆平
【关键词】 低氧诱导因子
【Abstract】 AIM: To investigate the expression and action of HIF1α and iNOS genes in inflammatory bowel diseases. METHODS: Paraffin embedded tissues from inflammatory bowel disease which had been diagnosed by clinical， endoscopic， histological and radiological examinations were used and immunohistochemistry method was performed to detect the expression of HIF1α and iNOS genes. RESULTS: The median of HIF1α positive expression rate was 54%， 59% and 1%， and that of iNOS expression was 58%， 54% and 2% in 47 ulcerative colitis， 13 Crohn’s disease and 10 normal colon mucosa respectively. The HIF1α and iNOS expression of ulcerative colitis and Crohn’s disease was significantly different from that of normal colon mucosa (P&<0.01)， while no difference was found between Crohn’s disease and normal colon mucosa (P&>0.05). Linear correlation analysis showed that iNOS protein was positively correlated with HIF1α protein (ulcerative colitis: r=0.627; Crohn’s disease: r=0.610， P&<0.05). CONCLUSION: HIF1α and iNOS are involved in the pathogenesis of inflammatory bowel diseases and HIF1α may be an essential regulator of iNOS gene expression.
【Keywords】 inflammatory bowel disease；hypoxiainducible factor1alpha； inducible nitric oxide synthase；immunohistochemistry
【摘要】 目的：探讨低氧诱导因子1α（HIF1α）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）在炎症性肠病(IBD)中的表达及作用. 方法：取经过临床表现、内镜、病理、影像学等方法共同确诊的IBD活检的石蜡标本，用免疫组织化学方法检测HIF1α和iNOS蛋白表达情况. 结果：在47例溃疡性结肠炎(UC)、13例克隆病(CD)和10例正常结肠黏膜组织中，HIF1α蛋白的细胞表达阳性率中位数分别为54%，59%和1%，前两者分别与后者比较有显著性差别（P&<0.01），而前两者之间比较无显著性差别（P&>0.05）；iNOS蛋白的细胞表达阳性率中位数分别为58%，54%和2%，前两者分别与后者比较有显著性差别（P&<0.01），而前两者之间比较无显著性差别（P&>0.05）；HIF1α和iNOS蛋白水平呈正相关（溃疡性结肠炎:r=0.627；克隆病:r=0.610）(P&<0.05). 结论：HIF1α和iNOS蛋白均参与了IBD的发病，HIF1α可能是iNOS基因表达中的一个重要调节者.
【关键词】 炎症性肠病；低氧诱导因子1α；诱导型一氧化氮合酶；免疫组织化学
0引言
炎症性肠病（inflammatory bowel disease， IBD），是一组病因不明的慢性肠道性疾病，它包含了两个独立的疾病，即溃疡性结肠炎(ulcerative colitis， UC)和克隆病（Crohn’s disease， CD）. 迄今，IBD的病因和发病机制尚不清楚，一般认为是由遗传、环境、免疫等因素相互作用而引起的一种肠道炎症为主要表现的慢性疾患，其中炎性介质起重要作用［1］. 低氧诱导因子1α（HIF1α）是在研究低氧诱导的红细胞生成素（EPO）基因表达时被发现的，HIF1α作为基因转录的核调节因子，是低氧适应和病理反应中的一个特异的中介因子. 研究发现［2-4］许多低氧反应基因如诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因表达调控区都有HIF1α的结合位点，HIF1α与iNOS基因调控区的特异位点结合而调节其表达. 大量资料［1，5］表明一氧化氮（nitric oxide， NO）作为重要的炎症介质参与IBD的发生和发展，存在于结肠黏膜的iNOS在结肠炎症过程中的表达亦相应增强. 我们旨在观察HIF1α在IBD中的表达情况以及初步探讨HIF1α与iNOS基因的关系.
1材料和方法
1.1材料
收取武汉五家医院病理科199001/200312活检石蜡IBD标本60例，均经临床、内镜、大便培养、病理学、影像学等确诊. 其中，UC 47（男34，女13）例，年龄8～64（37±14）岁；CD 13（男9，女4）例，年龄20～70（39±15）岁. 正常对照组10例取自肠癌手术切除标本残端的正常部分. 兔抗人HIF1α、兔抗人iNOS多克隆抗体购自武汉博士德生物工程公司，抗体工作浓度均为1∶80. SP试剂盒为美国MAXIM公司产品，购自福州迈新公司. 烤箱、医用微波炉、冰箱、显微镜、HPIAS2000图像分析软件.
1.2方法
1.2.1免疫组化切片除作常规HE染色外，余作免疫组化染色，即石蜡切片脱蜡水化，采用枸橼酸微波SP法，DAB显色，苏木精复染，具体操作按SP试剂盒说明书进行. 用PBS替代一抗作为阴性对照，余步骤相同.
1.2.2结果判定HIF1α蛋白以细胞核或胞质内有棕黄色颗粒为阳性细胞，iNOS蛋白以胞质或膜上出现棕黄色颗粒为阳性细胞. 每张切片在400倍显微镜下随机选定10个视野，采用全自动图像分析仪，HPIAS2000图像分析软件，分别扫描记录阳性细胞表达百分数，取其平均数.
统计学处理: 采用KrusKalWallis非参数检验，相关分析采用Spearman等级相关分析，P&<0.05代表结果有显著性差异，采用SPSS 11.5统计软件进行分析.
2结果
2.1HIF1α和iNOS蛋白表达HIF1α在正常肠组织中不表达或者有微弱的表达（Fig 1），而在IBD的肠腔和腺体的上皮细胞、血管内皮细胞、基质的结缔组织细胞及肠组织的炎性细胞（淋巴细胞和巨噬细胞）中表达明显增强（Fig 2，3），特征为胞质或胞核显黄色或棕褐色；iNOS蛋白在正常肠组织黏膜中几乎不表达（Fig 4），而在IBD组织的上皮细胞、血管内皮细胞、结缔组织细胞，肠组织的炎性细胞中表达明显增强（Fig 5，6）. 经计算机图像分析，HIF1α在47例UC，13例CD和10例正常结肠黏膜组织中的细胞表达阳性率中位数分别为54%，59%和1%. 前两者分别与后者比较有显著性差别（P&<0.01），而前两者之间比较无显著性差别（P&>0.05）. iNOS蛋白的细胞表达阳性率中位数分别为58%，54%和2%，前两者分别与后者比较有显著性差别（P&<0.01），而前两者之间比较无显著性差别（P&>0.05）.
2.2HIF1α和iNOS蛋白的关系HIF1α和iNOS蛋白在IBD病变组织中表达明显增强，并且表达细胞类型和部位基本一致，HIF1α和iNOS蛋白在IBD中表达成正相关（UC:r=0.627; CD:r=0.610） (P&<0.05).
3讨论
HIF1α是HIF1的功能亚基，一般在缺氧条件下激活表达，是调节缺氧反应性基因表达的共同分子通路，也有研究发现IL1β和TNFα也能激活HIF1α而诱导其表达［6，7］.
我们的实验结果表明，HIF1α在正常的肠黏膜组织中几乎不表达，而在炎症性肠病中表达明显增强，HIF1α可能在IBD中发挥重要的调节作用，与Giatromanolaki等［8］报道的基本一致. 根据以上结果，我们推测HIF1α在IBD中表达增强的可能机制是：炎症性肠病肠上皮的损伤和再生在整个疾病的过程中都出现，并且加速；血管和淋巴细胞的增生以及细胞代谢的增加、血小板被大量激活、血管收缩、微血栓形成等，影响肠黏膜微循环，加重肠黏膜缺氧损伤，这些都可能给组织造成低氧的微环境；氧化应激可能直接或者是促进结缔组织细胞释放细胞因子从而进一步促进HIF1α表达；细胞因子IL1β和TNFα也可能诱导HIF1α表达的增加.
NO在IBD中是一种重要的炎症介质，它主要由iNOS诱导产生，iNOS在生理情况下几乎不表达，当受到某些因素刺激后即被激活，大量产生iNOS. 研究表明［5］，NO在IBD的炎症发生过程中有双重作用，在炎症初期，保护上皮，起抗炎作用，随着炎症的持续发展，NO大量产生释放，通过氧化破坏作用加重炎症. 我们的结果表明iNOS在正常肠黏膜组织中几乎不表达，而在IBD中表达明显增强，与文献报道一致.
目前，有关HIF1α与iNOS关系的研究主要在基础方面，Jung等［2］研究了在体内和体外缺氧条件下的心肌细胞，发现iNOS基因增强子的DNA序列中存在HIF1α的结合的特异位点，在低氧条件下能够促进iNOS基因的表达，同时还发现IL1β对HIF1α诱导iNOS基因的表达有协同作用，故认为HIF1α是iNOS基因转录活化的一个重要调节因子. Hu等［3］及Hierholzer等［11］也研究报道HIF1α能够上调缺氧性肺动脉高压大鼠以及缺血性休克中iNOS基因的表达，从而参与发病. 这些研究提示，iNOS基因表达时，HIF1α在其信息传递中可能起着关键作用. 我们的实验结果显示，HIF1α和iNOS蛋白表达阳性的细胞类型和部位基本一致，并且统计学结果显示HIF1α与iNOS蛋白表达存在一定的正相关，即在IBD中HIF1α在低氧及细胞因子（IL1β和TNFα）的刺激下激活，继而迅速诱导iNOS基因的表达产生大量的NO，从而参与IBD的炎症反应和免疫调节网络中.
HIF1α所调控的低氧反应基因中很多都参与了IBD的形成和发展，并且这些基因的表达和调控还需要其他转录因子的参与，因此进一步研究HIF1α和与其相互作用的转录因子及其所调控的基因，将对阐明炎症性肠病发生发展的分子机制和防治提供新的途径.
参考文献
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