作者：于哲，范清宇，郝新保，龙华，刘云燕，文艳华，赵宏
【关键词】 骨肉瘤
【Abstract】 AIM: To evaluate the therapeutic effectiveness of tumor vaccine from fusion of dendritic cells (DCs) with the osteosarcoma cells in osteosarcoma. METHODS: The UMR106 cell line was injected subcutaneously into the SD rat thigh laterally to establish the animal model. DCs obtained from SD rat bone marrow were propagated in vitro under the condition of rGMCSF， rIL4 and nrhTNFα. DCs were purified by monoclonal antibody OX62 and magnetic beads. Then the UMR106 cell line was fused with DCs to obtain the tumor vaccine and the therapeutic effectiveness of the tumor vaccine to the original tumor and lung metastasis in the animal model was observed. RESULTS: Six weeks after the treatment with tumor vaccine， the weight of the original tumor and the rate of lung metastasis in the therapeutic group were both largely reduced compared with those in control groups （P&<0.01）. CONCLUSION: The fusion tumor vaccine perhaps can be used in the clinical treatment of osteosarcoma.
【Keywords】 dendritic cells；osteosarcoma；immunotherapy
【摘要】 目的: 探讨大鼠树突状细胞(dendritic cells， DCs)融合瘤苗在骨肉瘤免疫治疗中的应用. 方法: 用大鼠骨肉瘤细胞系UMR106建立大鼠骨肉瘤动物模型，应用重组大鼠rGMCSF， rIL4和nrhTNFα培养大鼠骨髓前体细胞获得大量DCs，经标抗大鼠OX62 mAb免疫磁珠分离纯化后的DCs经形态学观察、表型检测、功能学实验鉴定，然后将细胞系UMR106与大鼠树突状细胞融合作为瘤苗应用于荷瘤大鼠，观察其抑制肿瘤生长和肺转移的效果. 结果: 在治疗6 wk时治疗组和对照组相比，瘤重明显减小（P&<0.01）；肺转移发生率降低（P&<0.01）. 结论: 大鼠骨肉瘤细胞系UMR106与树突状细胞的融合瘤苗可望在骨肉瘤的治疗中发挥作用.
【关键词】 树突状细胞；骨肉瘤；免疫治疗
0引言
骨肉瘤是常见的恶性程度极高的骨源性肿瘤，患者往往在术前就已经有了微小肺转移灶，加之局部复发，预后很差. 由于放疗的不敏感、化疗的抗药性等局限，临床上愈加关注对骨肉瘤开展免疫治疗的研究，制备肿瘤疫苗为其主要手段之一. 树突状细胞(dendritic cells，DCs)是目前为止发现的功能最强的专职抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC），由于其形状似树突而得名. 它对诱导初次免疫应答具有独特的功能，能摄取和加工提呈抗原，表达高水平的MHC分子、共刺激分子、黏附分子并分泌高水平TH1型细胞因子IL12，启动T细胞介导的免疫反应. 目前关于DCs在肿瘤免疫治疗中的应用，已经成为肿瘤免疫治疗的热点之一. 我们应用大鼠骨髓来源的DCs与大鼠骨肉瘤细胞系UMR106融合，制备肿瘤疫苗，观察其治疗效果，探讨其临床应用的可能性.
1材料和方法
1.1材料
仪器和主要试剂: MiniMACS磁性分离仪(德国Miltenyi Biotec GmbH公司)；流式细胞仪(美国BD Phar Mingen公司)；细胞融合仪(BTX公司的2001型)；大鼠骨肉瘤细胞系UMR106(美国American Tissue Culture Collection）；6～8 wk龄SD大鼠(第四军医大学实验动物中心提供)；小牛血清和RPMI 1640培养基(美国HyClone公司)；淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技有限公司)；rGMCSF， rIL4 (R＆D公司)；新型重组人肿瘤坏死因子nrhTNFα(第四军医大学生物技术中心)；FITC标记抗大鼠MHCⅠ和MHCⅡ， FITC标记抗大鼠OX62， PE标记抗大鼠CD80， PE标记抗大鼠CD86(英国Serotec公司).
1.2方法
1.2.1细胞培养与融合
1.2.1.1制备大鼠骨髓细胞将健康雄性6～8 wk SD大鼠断颈处死，浸入750 mL/L的乙醇中10 min，无菌手术取出双侧股骨和胫骨，剥净肌肉组织，用PBS洗涤2遍，剪去骨两端，再洗涤2遍；用无菌注射器抽取5 mL无血清RPMI 1640，将其针头分别从两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓直至骨变白，收入50 mL离心管中，1500 r/min离心收集骨髓细胞，弃上清，沉淀细胞用5 mL无血清RPMI 1640重悬，再经淋巴细胞分离液密度梯度离心，初步纯化单个核细胞(mononuclear cells，MNCs)，离心洗涤2次，收集沉淀的骨髓细胞.
1.2.1.2DCs的培养扩增取初步纯化的MNCs，重悬于含100 mL/L的小牛血清的RPMI 1640培养液中，置于50 mL细胞培养瓶中，加细胞因子rGMCSF(终浓度为1×106 U/L)，rIL4（终浓度为0.5×106 U/L）及nrhTNFα(终浓度为1×106 U/L) ［1-3］，于37℃，50 mL/L CO2条件下培养，每3日半量换液，补加细胞因子1次，于第12日收获悬浮细胞.
1.2.1.3DCs的形态学检测倒置显微镜每日观察细胞生长情况及形态变化并摄片；扫描电镜观察由我校电镜中心协助完成.
1.2.1.4DCs的表型检测选用FITC标记的MHCⅠ， MHCⅡ和OX62，PE标记的CD80、CD86，分别收集诱导前4， 8和12 d细胞悬液，调整细胞密度至5×109/L，各取50 μL，加1∶20灭活正常兔血清10 μL，4℃封闭10 min，再分别加入上述mAb，4℃避光30 min，PBS洗2次，流式细胞仪检测.
1.2.1.5应用标抗大鼠OX62 mAb免疫磁珠分离纯化DCs用MiniMACS分离柱筛选，标记细胞在通过置于磁场中的分离柱时，去除膜表面不表达OX62的细胞，将分离柱移出磁场，加压洗脱，收集OX62＋细胞，具体操作按说明书进行.
1.2.1.6骨肉瘤细胞的培养和融合大鼠骨肉瘤细胞系UMR106培养在含100 mL/L的小牛血清的RPMI 1640培养液中，呈单层生长. 分别收集培养的DCs和骨肉瘤细胞，用细胞融合仪融合，操作按说明书进行.
1.2.1.7融合细胞的筛选待融合细胞在培养瓶中生长24 h后，用MiniMACS分离柱筛选，去除膜表面不表达OX62的细胞，即去除未融合的肿瘤细胞.
1.2.1.8融合细胞的生长特性将融合细胞接种在96孔培养板中，采用MTT比色法测定细胞生长曲线.
1.2.1.9融合细胞的表型检测同检测DCs表型方法，流式细胞仪测定融合细胞表面MHCⅠ，MHCⅡ类抗原和OX62的表达水平.
1.2.2骨肉瘤大鼠模型的制备收集培养的UMR106，洗1次，调整细胞浓度，在每只SD大鼠右后肢外侧皮下接种1×107个细胞，共60只雄性6～8 wk龄SD大鼠，体质量（125.45±8.19）g.
1.2.3免疫治疗大鼠在接种肿瘤细胞3 d后被随机等分为3组进行治疗，即融合细胞治疗组（DUF）、肿瘤细胞组（UMR）和生理盐水对照组（CON）. 用于治疗的2×106个融合细胞经30 Gy的60Co射线照射后接种在腹股沟皮下，每周1次，连续5 wk，于第6周处死动物，称量肿瘤大小及肺转移情况.
统计学处理：各组肿瘤质量比较采用KruskalWallis H检验及Nemenyi法检验，各组肺转移率比较采用χ2检验，P＜0.05认为有统计学意义.
2结果
2.1DCs的形态倒置显微镜下可见，前3 d大部分细胞呈贴壁生长，体积小、形圆，细胞边界光滑；4～8 d悬浮细胞数量增多，体积增大，细胞边界渐趋粗糙；9～12 d大部分细胞呈悬浮生长，细胞数量进一步增多，体积进一步增大，边界可见明显的毛刺样突起（Fig 1）. 扫描电镜见细胞表面存在大量褶皱和典型的不规则突起(Fig 2).
2.2DCs的表型检测结果诱导前细胞表面各抗原阳性率分别为OX62，7.48％；MHCⅠ，39.45％；MHCⅡ，28.24％；CD80，2.60％； CD86，6.08％. 经rGMCSF， rIL4和nrhTNFα诱导活化并经免疫磁珠分离纯化后，各抗原阳性率较诱导前均有不同程度的升高，分别为OX62，62.19％；MHCⅠ，70.40％；MHCⅡ，78.28％；CD80，55.58％； CD86，68.38％.
2.4融合细胞的表型检测结果经过筛选的融合细胞各种表面抗原的表达水平均较高，分别为OX62，88.26％；MHCⅠ，84.77％；MHCⅡ，85.87％.
2.5融合瘤苗诱导的原位瘤生长抑制UMR106细胞接种的SD大鼠1 wk内全部可以摸到肿瘤生长（Fig 4），治疗5 wk后处死动物测定肿瘤大小并称其质量（Tab 1）.表1融合瘤苗治疗效果的比较
2.6融合瘤苗对肺转移的抑制对照组肺转移率高达75％（Fig 5）；融合瘤苗治疗组的肺转移率明显降低（Tab 1），且肺表面的转移结节数也明显减少，融合细胞治疗组（DUF）、肿瘤细胞组（UMR）和生理盐水对照组（CON）的平均肺转移结节数分别为61， 164和188.
3讨论
APC主要包括巨噬细胞、树突状细胞和活化的B淋巴细胞，它们表面均表达高水平的MHC抗原和共刺激分子. 本实验室在1999年成功制备了巨噬细胞融合细胞瘤苗［4］，并在临床试验中取得了较满意的结果. DCs表面的MHC/抗原肽段表达水平比巨噬细胞和B细胞高10～100倍，因此其抗原呈递能力强于巨噬细胞，DCs可呈递pmol/L和nmol/L水平的抗原，而其他APC只能呈递mmol/L水平的抗原，体内体外，仅需少量DCs即可启动T细胞免疫. 但DCs在血液和组织中含量稀少，只占PBMC的0.1％～0.5％［5］，体外诱导相对困难，极大限制了DCs的研究和应用. 我们采用重组大鼠rGMCSF， rIL4和nrhTNFα联合诱导大鼠骨髓前体细胞，经体外扩增后从每只大鼠骨髓中可以获得1×107的DCs，基本可以满足实验对DCs数量上的需求.
由于将肿瘤细胞直接作为瘤苗使用效果并不明显，目前大多数采用基因转染技术对肿瘤细胞加以修饰，来提高其免疫原性［6］. 但对于mAb未知，或者mAb特异性不够理想的肿瘤，该方法的推广必然受到限制. 1994年，Guo等［7］首次以活化的B淋巴细胞与肝癌细胞相融合，使融合细胞表达高水平的MHC分子和共刺激分子，并能诱导出强烈的抗肿瘤免疫应答，该研究启发人们可以用细胞融合技术来改变肿瘤细胞的抗原特性. 细胞融合技术最大的优点就在于融合细胞能够呈递肿瘤细胞所有的抗原，包括已知的和未知的mAb，可以获得较好的诱导T细胞杀伤作用的效果.
在本研究中，我们采用电融合技术成功地制备了树突状细胞融合瘤苗，电融合的效率通常比化学融合法提高1～2个数量级［8］，这在很大程度上弥补了DCs数量较少的缺陷. 融合细胞瘤苗在对大鼠的主动免疫治疗中取得了较满意的结果，融合细胞生长速度变慢；在对荷瘤大鼠做免疫治疗时，治疗组的肿瘤体积显著小于对照组（P＜0.01），肺转移率降低（P＜0.01），转移结节减少，而肿瘤对照组和生理盐水对照组则无显著性差异（P＞0.05）. 该研究结果表明，树突状细胞融合细胞瘤苗具有潜在的临床应用价值，如果能把这种抗原提呈功能最为强大的APC和有代表性的人体骨肉瘤细胞系相融合，制备出新型的融合细胞瘤苗，则该瘤苗的应用有望显著提高骨肉瘤患者的存活率.
【
参考文献
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