作者：廖飞，朱小云，王咏梅，曾昭淳，左渝萍
【关键词】 尿酸酶
【Abstract】 AIM: To test the reliability of the integrated method for the assay of enzyme activity at substrate concentration above the MichaelisMenten constant (Km). METHODS: Uricase reaction curve was monitored by absorbance at 293 nm， and it was fit to the integrated MichaelisMenten rate equation with the predictor variable of reaction time for irreversible， single substrate reaction with the background absorbance as a nonlinear parameter while Km as a preset constant. RESULTS: Vm was sensitive to residual substrate concentration while it was resistant to the background absorbance. With residual uric acid below 2.5 μmol/L， there were no differences among Vm at initial substrate concentrations from 10 to 70 μmol/L. There were linear responses of both Vm and initial rates to the amount of uricase with initial substrate concentration at 25 or 70 μmol/L if the residual substrate was below 2.5 μmol/L. The lower limits of Vm by this integrated method showed no difference at these two initial substrate concentrations and were comparable to those of initial rates. But the upper limit of Vm was twice above that of initial rate， and this difference was more pronounced at lower substrate concentrations. CONCLUSION: This integrated method with reaction time as the predictor variable in the integrated rate equation is reliable for enzyme activity assay at substrate concentration above the Km.
【Keywords】 The integrated Method; uricase; initial rate; predictor variable; upper limit; substrate concentration; enzyme activity assay
【摘要】 目的: 以尿酸酶为模型，考察在底物浓度高于酶米氏常数(Km)时用积分法测定酶活性(Vm)的可靠性. 方法: 用293 nm光吸收记录尿酸酶反应曲线. 用以反应时间为自变量的积分速度方程，以尿酸酶Km为常数而本底为非线性参数拟合尿酸酶反应曲线，搜寻对应最好拟合的Vm. 结果: 此积分法测定Vm主要受剩余底物浓度影响，本底基本没有干扰. 剩余底物低于2.5 μmol/L时用10~70 μmol/L起始底物所得Vm无差异. 用25和70 μmol/L起始底物浓度时初速度和Vm都与酶量呈正比. 在此两种底物浓度下积分法的下限相同，且与初速度法下限无明显差异. 但用积分法测定酶活性的上限明显高于初速度法，而且起始底物浓度越低则差异越显著. 结论: 在积分法中使用以反应时间为自变量的积分速度方程拟合酶反应曲线，在高于Km的底物浓度下能可靠测定酶活性.
【关键词】 积分法； 初速度； 尿酸酶； 自变量； 上限； 底物浓度； 酶活性测定
0引言
底物浓度受成本、溶解度或仪器直接测定底物的范围限制时，测定酶反应初速度上限通常很低. 用以反应时间为自变量的积分速度方程拟合酶反应曲线，可用很低浓度底物测定最大反应速度(Vm)，而且上限很高［1-4］. 此积分法可用于单底物和双底物酶［3］，还可用于筛选酶抑制剂［4］. 理论上此积分法所测定Vm应和底物浓度无关［2］. 但当底物浓度高于芳香酯酶酶米氏常数(Km)的25％［2］，或高于谷胱甘肽S转硫酶表观Km一半［3］，积分法所得Vm随底物浓度升高而逐步降低. 当酶Km很低且定量灵敏度很低时，积分法需要较高底物浓度才能获得足够数据用于曲线拟合. 但在较高底物浓度下此积分法是否可靠还未确定. 尿酸酶反应曲线容易测定，动力学过程简单［5］. 我们用纯化的candida utilis尿酸酶为模型，考察在高于酶Km的底物浓度下用积分法测定酶活性的可靠性.
1材料和方法
1.1材料
尿酸和candida utilis尿酸酶(EC 1.7.3.3)购自ICN， candida species尿酸酶购自Sigma. 其余试剂为分析纯.
1.2方法
1.2.1反应曲线记录缓冲液为50 mmol/L硼酸钠（pH 9.2， 含50 mol/L铁离子络合剂二乙基三氨基五乙酸） ［5，6］. 测定体系含1.0 mL缓冲液，及适量底物和酶液共1.20 mL. 用Shimadzu UV 265在(25±1)℃记录启动反应30 s后的吸收变化曲线，间隔为10 s，直到光吸收变化降低到刚开始阶段的10％以下. 初速度为从对应起点开始反应半分钟的平均速度.
1.2.2测定Vm取尿酸在293 nm的消光系数(ε) 为11.5 (mmol/L)-1・cm-1. 对于存在恒定本底的反应体系，任意反应时刻(ti)的吸收(Ai)同尿酸浓度(Si)关系为Eq(1).
Ai=ε×Si+Ab(1)设初始尿酸浓度为S0， 将其单底物不可逆反应速度方程积分得Eq(2)［1-3，7-9］.
ln(S0/Si)+(S0-Si)/Km=(Vm/Km)×ti(2)以启动反应40 s的数据点(ts， As，0)为起点（其吸收A0，s为起点吸收而反应时间为零，即t’i=ti-ts）. 双倒数分析独立测定candida utilis尿酸酶Km 为12.5 μmol/L（未发表数据）. 把被分析酶的Km设为对应的固定常数，则根据Eq(1)可将Eq(2)左边转变成yi.
yi=ln(A0，s-Ab)+A0，s/(ε×Km)-ln(Ai-Ab)-Ai/(ε×Km)(3)长下调到-0.020），据误差传递确定yi的误差，以其误差平方的倒数加权，方差分析为判据，用Eq［4］非线性拟合反应曲线［1-6］，
yi=a+b×t’i(4)或同时以Km 为非线性参数拟合反应曲线，对应最好拟合的参数Ab， Vm/Km ［Eq(4)中的斜率］组合为所需参数，根据预设常数Km计算得Vm ［1-3］. 用经典积分法时数据转换同文献，仍然用本底为非线性参数在相同范围调节搜寻对应最好拟合的参数［7］.
1.2.3程序设计参照以前用Qbasic 4.5编写，数据转换和加权因子相应按上述方程确定［1-3，8，9］.
统计学处理： 用决定系数(R2)判断用Eq［4］拟合反应曲线及酶活性对酶量响应曲线的线性程度，用单因素方差分析比较均值的差异.
2结果
以Km为常数时此积分法测定candida utilis尿酸酶Vm受剩余底物浓度影响；但不受本底干扰. 初始尿酸为70 μmol/L时，剩余底物从2.5 μmol/L升高到10 μmol/L 使Vm增加50%；但剩余底物浓度在2.5 μmol/L以下变化所引起的Vm变化&<2%. 用10~70 μmol/L尿酸测定Vm的变异系数都&<5%，数据转换后用Eq(4)拟合反应曲线的决定系数都&>0.995 (n=5). 剩余底物低于2.5 μmol/L时用10~70 μmol/L底物所得Vm无显著差异而初速度随底物浓度呈显著变化 (Tab 1). 用此积分法在70 或25 μmol/L底物时所得Vm对尿酸酶量都成正比（Fig 1，回归分析决定系数&>0.998）. 以偏离响应直线小于回归估计标准差的两倍为界限，在25 μmol/L尿酸时此积分法测定Vm的上限同用70 μmol/L尿酸时相比无差异. 以回归估计标准差两倍为下限，只要剩余底物低于2.5 μmol/L，在上述两种底物浓度下测定Vm 的下限也无差异. 但初始底物为70 μmol/L时需要更长的反应时间才能达到所要求的剩余底物浓度.表1初始底物浓度对不同方法测定尿酸酶活性的影响（略）
在初始底物为50 μmol/L时，以Km 为参数拟合剩余底物在5 μmol/L以下的反应曲线测定Vm的变化&<6% (n=8). 以Km为参数分析剩余底物&<10%的反应曲线，底物浓度在15~70 μmol/L之间变化时所得Vm也无显著差异(数据未给). 在竞争性抑制剂黄嘌呤(10 μmol/L)存在下，只要初始底物浓度高于表观Km而剩余底物低于2.5 μmol/L，所得Vm也无明显变化. 但对来自candida species尿酸酶的反应体系，只有剩余底物低于1.0 μmol/L且初始底物浓度在较小范围内变化所得Vm才无变化. 把本底作为非线性参数，用经典的积分速度方程经过数据转换后拟合分析相同的candida utilis尿酸酶反应曲线［7］，当分析包含启动反应30 s前的数据，或被分析反应曲线数据中含有本底，或初始底物浓度低于12 μmol/L时，所得Vm中都有接近30％为无意义的负值.
3讨论
Eq(4)只能描述稳态反应过程，分析启动反应40 s后的数据有利于保障结果的可靠性. 用candida utilis尿酸酶表明，底物浓度从接近于Km上升到Km的五倍也不改变Vm；且所得Vm都对酶量为线性响应；据初速度和Vm关系计算所得Km也和双倒数法结果一致. 可见在高于酶Km的底物浓度下用此积分法测定Vm仍是可靠的. 在底物浓度远低于Km时此积分法的可靠性已证实［1-4］. 因此，此积分法所测定的酶活性与底物浓度无明显联系，需要时就可用高于Km的底物浓度测定酶活性. 芳香酯酶在底物浓度高于Km的25％以后下降，谷胱甘肽S转硫酶在底物浓度高于50％Km以后也下降，可能是酶样品纯度低，所用积分速度方程和真实速度方程有差异造成的［2，3］. Cadida species尿酸酶的Km接近6 μmol/L ［10］. 底物浓度相对于Km足够高后初速度上限难以再提高. 而测定Km为12.5 μmol/L的candida utilis尿酸酶表明，积分法在低浓度底物时上限仍然比用底物浓度五倍于Km的初速度上限高. 比较以Km为常数和Km为参数测定酶活性表明，以Km为常数用此积分法测定酶活性更有利. 因此，此积分法测定酶活性对底物浓度无依赖，可根据定量灵敏度和测定上限的需要使用低于或略高于酶Km的底物浓度，从而用方便的定量方法和较低的底物浓度就达到所需要的测定上限. 但此积分法测定低活性的样品时需要很长反应时间是其明显缺陷.
经典积分速度方程所用自变量含有误差且分布范围窄［7］，用于分析实验曲线给出无意义Vm，表明其不能用于实践. 我们所述积分法所用积分速度方程以反应时间为自变量，无随机误差但有反应起点不确定造成的系统误差. 选择所记录曲线上达到稳态反应的反应时刻对反应时间进行转换，可降低反应起点误差的干扰. 实际上此积分法所需参数都和反应起点无关，所测参数受起点误差的干扰肯定很小. 这种自变量性质的差异可能是两种积分法的可靠性存在差异的主要原因. 已发现在积分法中用以反应时间为自变量的积分速度方程拟合分析反应曲线还可预测最大产物生成量［8-9］，或预测本底进行动力学法测定底物量，也可测定不高于初始底物浓度的Km （未发表数据）. 综上所述，只要所用微分速度方程有效，用其对应的以反应时间为自变量的积分速度方程拟合分析酶反应曲线有望可靠测定酶活性等参数.
致谢兰州大学生命科学院钟其顶、李士勇在重庆医科大学完成了candida species尿酸酶的实验.
参考文献
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