作者：赵建洪，程彦斌，张正义，纳涛
【关键词】 肿瘤坏死因子
【Abstract】 AIM: To explore the protective effects and mechanism of morphine in acute myocardial ischemia reperfusion (AMIR) injury in rats and its influence on apoptosis of cardiomyocytes. METHODS: Seventy SD rats were included in the study， among which， forty were pided randomly into 4 groups: group A (n=10， ischemiareperfusion group)， group B (n=10， morphine preconditioning group)， group C (morphine and naloxnehydrochorid group)， and group D (normal control group). Thirty SD rats were used to calculate myocardial infarct size， with 10 in each group (A， B and C). The rat model of AMIR was established by tying and untying the left anterior descending branch (LAD) of rat coronary. The animals were then sacrificed and hearts were harvested for the determination of myocardial infarct size by TTC. The expression of Bcl2 protein was observed by immunohistochemical technique. Radioimmunoassay was used to detect tumor necrosis factor alpha (TNFα) in serum and routine method was used to detect creatine kinase (CKMB)in serum. RESULTS: The myocardium infarct size was smaller in group B than that in group A ［(21.8±4.5) vs (37.5±5.8)， P&<0.01］. The expression of Bcl2 protein in group B () increased significantly as compared with that in group A (+). TNFα and CKMB were significantly lower in group A than those in group B ［(0.42±0.08) vs（0.86±0.11）， P&<0.01; (39374±7885) vs（58511±4950）， P&<0.05］. CONCLUSION: Morphine can protect myocardium from AMIR injury by inhibiting the apoptosis of cardiomyocytes induced by TNFα and by upregulating protein expression of Bcl2 gene.
【Keywords】 myocardial ischemic; reperfusion injury;gene expression; tumor necross factor; genes， bcl2; morphine; rats， SpragueDawley
【摘要】 目的： 探讨吗啡对急性心肌缺血/再灌注损伤的保护作用和机制，以及对心肌细胞凋亡的影响. 方法： SD大鼠70只，其中40只随机分成4组： A组（n=10，单纯缺血再灌注），B组（n=10，吗啡预处理），C组（n=10，吗啡＋纳络酮），D组（n=10，正常对照）. 其余30只做心肌梗死面积测定(A， B， C组各10只). 实验动物采用戊巴比妥钠（40 mg/kg） ip麻醉，开胸，打开心包，穿线结扎左冠状动脉前降支制备大鼠心肌缺血再灌注模型. 用免疫组织化学法检测心肌组织Bcl2基因蛋白表达;用放免法测定血清中TNFα的含量，同时测定血清中肌酸磷酸激酶同功酶（CKMB）的含量；用TTC法染色，用图像分析系统计算心肌梗死面积（n=30）. 结果： 与A组比较，B组梗死面积明显缩小［(21.8±4.5) vs (37.5±5.8)， P&<0.01］；Bcl2基因蛋白表达明显增加() vs (+)；TNFα明显降低［(0.42±0.08) vs （0.86±0.11）， P&<0.01］，CKMB明显降低［(39374±7885) vs （58511±4950）， P&<0.05］. 结论： 吗啡预处理可抑制TNFα产生，并通过上调Bcl2基因蛋白表达，抑制缺血/再灌注后心肌细胞的凋亡，从而保护缺血再灌注对心肌细胞的损伤.
【关键词】 心肌缺血；再灌注损伤；基因表达；肿瘤坏死因子；基因，bcl2;吗啡;大鼠，SpragueDawley
0引言
心肌缺血/再灌注损伤目前仍是冠状动脉再通术后一个重要的并发症，也是致死的主要原因之一. 其病因复杂，发生机制至今尚未完全阐明. 近几年随着分子生物学的进展和在心血管病学研究中的应用，发现细胞凋亡现象存在于心血管系统的许多生理病理过程中. 有学者提出，细胞凋亡可能为再灌注损伤发病机制中的一个重要环节，通过干预凋亡基因的表达可阻断细胞凋亡过程，从而减轻再灌注损伤. 在哺乳类动物，凋亡抑制基因bcl2被认为与细胞凋亡密切相关. 吗啡的药理作用广泛，对急性心肌梗死，它可以止痛、镇静、消除恐惧与焦虑、降低交感神经活性，并减轻心脏负担，但它对心肌缺血再灌注后心肌细胞的凋亡及凋亡相关基因Bcl2蛋白表达有何影响，至今尚未见文献报道，为此本研究对此作初步探讨.
1材料和方法
1.1材料
SD大鼠70只，体质量（250±30） g，雌雄不拘，由兰州医学院实验动物中心提供. 主要试剂: 吗啡(1 mL∶10 mg， 103264)由沈阳第一制药厂制造，使用前加入生理盐水配制成1 g/L. 盐酸纳络酮(1 mL∶0.4 mg， 0207152)由军事医学科学院研制，北京四环医药科技股份有限公司惠赠. 氯化三苯基四氮唑（TTC）由E，M，K进口分装（上海）. Bcl2免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司. TNFα放免试剂盒由北京东雅生物技术研究所生产(50T). 主要仪器: 动物人工呼吸机(DH1，浙江大学医学仪器厂);心电图机(SB613D，日本);石蜡切片机(AO820，美国).
1.2方法
1.2.1心肌缺血/再灌注动物模型的建立SD大鼠经ip戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，仰卧固定于鼠台上，胸骨左侧去毛切开皮肤，切断3~5肋骨暴露心脏，剪开心包，用04号丝线结扎左冠状动脉前降支，术中用呼吸机维持人工呼吸. 心肌缺血30 min后，剪断结扎线恢复心肌再灌注4.5 h. 术前、结扎后和再灌注后各描记心电图1次. 以扎后ST段升高为心肌成功缺血. 仅穿线而未结扎者为假手术组.
1.2.2动物分组SD大鼠70只，其中40只随机分成4组，A组： (n=10)单纯缺血/再灌注组；B组： (n=10)吗啡干预组，缺血前10 min及再灌注2 h后ip吗啡0.36 mg/kg；C组: (n=10)吗啡＋纳络酮组，缺血前10 min及再灌注后2 h ip吗啡0.36 mg/kg和纳络酮0.52 mg/kg；D组： (n=10)正常对照组，只穿线不结扎，A组和D组于缺血前10 min及再灌注2 h后各注射与B组同体积的生理盐水. 其余30例心脏做心梗面积测定(A， B， C组各10只).
1.2.3Bcl2蛋白表达检测实验结束后，将SD大鼠ip戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，开胸，活体取出心脏，用冰生理盐水(4℃)将心脏清洗干净，放入40 g/L多聚甲醛固定24 h(4℃)后，常规石蜡包埋，于心肌梗死区中部沿左室轴线每隔1 mm连续切取数张5 μm厚的切片，作Bcl2蛋白表达检测;其步骤严格按试剂盒提供的方法（SABC法）进行免疫组化反应. 结果判断: 胞质中有棕黄色颗粒者为阳性表达细胞，无棕黄色颗粒者为阴性表达细胞. 镜下无阳性表达细胞者为阴性(-);阳性表达细胞数&<1/3视野者为弱阳性(+);介于1/3-2/3视野者为阳性();＞2/3视野者为强阳性().
1.2.4心肌梗死面积测定心脏摘取后用冰生理盐水(4℃)将心脏清洗干净，-20℃冻存，然后将心肌切成1 mm厚的薄片，置于pH 7.4的10 g/L TTC液中，37℃孵育10 min，测定心肌梗死面积.
1.2.5TNFα和CKMB的测定在缺血后10 min，再灌注4.5 h后各采2 mL血，4℃ 3000 r/min离心，取上清，测定TNFα和CKMB含量.
统计学处理： 实验数据由SPSS8.0软件进行统计学处理，结果以x±s表示. 心肌梗死面积的比较和同一时间点各组间比较用方差分析，同组不同时间比较用重复测量的方差分析，P&<0.05表示差异有统计学意义.
2结果
2.1Bcl2蛋白表达Bcl2蛋白阳性表达细胞主要位于心肌梗死区与非梗死区交界处. A组和C组有少量阳性表达细胞(+)，（Fig 1A， C ）；B组有大量的阳性表达细胞()，（Fig 1B）；D组无阳性表达细胞(-)，（Fig 1D）.
2.2心肌梗死面积A组心肌梗死面积为（37±6）% ，B组心肌梗死面积为（22±4）%，C组心肌梗死面积为（36±4）%，B组与A组和C组比较，心肌梗死面积缩小，有显著性差异(P&<0.01).
3讨论
已研究发现除中枢外，心肌细胞膜和血管壁等存在大量阿片肽κ， δ， μ受体系统，心脏亦可合成内源性阿片肽（EOP），提示阿片肽对心血管系统具有自分泌调节作用. 近年来，国内外的研究人员从不同的角度研究吗啡取得不少成果. 王欣等［1］研究发现，吗啡预处理可以减轻缺血心肌损伤及产生限制心肌梗死范围的心肌保护作用；吗啡是通过心脏局部的阿片受体介导，激活蛋白激酶C从而产生心肌保护作用. 江晓菁等［2］研究发现，吗啡可以减轻大鼠心肌的缺血/再灌注损伤；吗啡是通过心肌局部的阿片受体及心肌细胞的KATP通道介导产生心肌保护作用. 有人［3］报道，吗啡可抑制由TNFα诱导的中性粒细胞的活性，这种效应可被纳洛酮拮抗，同时发现中性粒细胞含有选择性的阿片μ3受体，吗啡可以通过阿片μ3受体的介导作用而抑制细胞因子对中性粒细胞活性的激活.
吗啡对细胞凋亡影响的研究也成为近年来的热点. 阿片肽和生物碱类是通过G蛋白双受体（G proteincoupled receptors， GPCRs）发挥它们的效应，一些GPCRs能激活磷脂酰肌醇3激酶/Akt（phosphatidylinositol 3kinase， PI 3K/Akt）信号转导路经，从而导致细胞存活；阿片受体的激活，经过依赖PI 3K的信号级联而促进神经元存活，同时也说明，Akt在抗凋亡效应中可能是下游的一个关键酶［4］. 已有的研究证实，吗啡无论在体内或体外均可抑制巨噬细胞的迁移，并且促使巨噬细胞的凋亡［5］. 单核/巨噬细胞表面有阿片受体，吗啡通过其受体来抑制TNFα的生成.
在心肌缺血/再灌注中，TNF不仅直接损害心肌组织，而且TNF/mTNFR1(transmembrane tumor necrosis factor receptor， mTNFR1跨膜肿瘤坏死因子受体)作为细胞因子网络中的一个重要环节，可以诱导产生其他多种炎性介质（如PLA2， PAF，氧自由基等），进一步造成心肌微循环障碍、缺血缺氧和弥散性微血管渗漏，大量炎性细胞浸润和聚集，并出现心肌细胞的水肿和炎性坏死［6］.
本实验结果显示，吗啡预处理后，TNFα和CKMB明显降低(P&<0.01， P&<0.05)，心肌梗死面积明显缩小（P&<0.05）. 这说明吗啡预处理可以有效抑制缺血/再灌注所致的心肌不可逆损伤，并产生缩小心梗范围的心肌保护作用. 进一步研究显示，吗啡预处理后，B组缺血心肌细胞Bcl2基因（凋亡抑制基因）蛋白表达明显高于A组，而A组和C组Bcl2基因蛋白表达无明显差异. 吗啡可能通过激活心肌细胞表面的阿片受体，经过依赖PI 3K的信号级联而促进心肌细胞的存活，同时Akt在抗心肌细胞凋亡中可能是下游的一个关键酶. 另外，吗啡还可抑制TNFα的产生，而TNFα可通过激活心肌细胞表面的TNFR1最终激活Caspase，引起心肌细胞凋亡［7］. 这从另一个角度说明吗啡通过抑制TNFα的产生，从而阻止心肌细胞的凋亡.
本实验的结果说明，吗啡通过阿片受体，抑制TNFα的产生，促进心肌细胞Bcl2基因蛋白表达，抑制心肌细胞的坏死与凋亡，最终达到保护心肌缺血再灌注损伤的目的.
【参考文献】
［1］ 王欣，李玉光，张元春，等. 阿片受体在缺血预处理中的作用［J］. 中华胸心血管外科杂志，2001：17（2）：93-95.
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［2］ 江晓菁，师恩，常业恬，等. 吗啡在大鼠心肌缺血再灌注中的保护效应［J］. 中华麻醉学杂志，2002；22（9）：559-561.
Jiang XJ， Shi EY， Chang YT， et al. The protective effects of morphine on ischemic reperfusion myocardium in rats ［J］. Chin J Anesthesiol， 2002; 22(9):559-561.
［3］ Wang TL， Chang H， Hung CR， et al. Morphine preconditioning attenuates neutrophil activation in rat models of myocardial infaraction ［J］. Cardiovasc Res， 1998;40(3):557-563.
［4］ Iglesias M， Segura MF， Comella JX， et al. Opioid receptor activation prevents apoptosis following serum withdrawal in differentiated SHSY5Y cells and cortical neurons via phosphatidylinositol 3kinase ［J］. Neuropharmacology， 2003;44(4):482-492.
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［6］ 杜成辉，方国恩，陈战，等. 跨膜肿瘤坏死因子受体在大鼠多器官功能障碍中的表达及其意义［J］. 第二军医大学学报， 2003；24（1）：73-76.
Du CH， Fang GE， Chen Z， et al. Expression of transmembrane tumor necrosis factor receptor in rats with multiple organ dysfunction ［J］. Acad J Sec Mil Med Univ， 2003;24(1):73-76.
［7］ 胡野，凌志强，单小云. 细胞凋亡的分子医学［M］. 北京： 军事医学科学出版社，2002：230-231.转贴于