作者：杜可军，柴玉波，常文辉，侯理朝，张晓楠，陈南春，林树新，陈苏民
【关键词】 免疫血清
【Abstract】 AIM: To express human lrg in E.coli and to obtain an anti-Lrg immune serum. METHODS: lrg cDNA was cloned into pcTAT vector. The fusion proteins were expressed in E.coli and purified by Ni-NTA column and SDS-PAGE. Rabbits were immunized with preliminary purified Lrg protein and reinforced three times. The antiserum was collected. RESULTS: Antiserum against Lrg was obtained in immunized rabbits and its titer was more than 1∶1000 proven by ELISA and Western Blot. The purified Lrg protein could get across membranes of Papilla Dental Cells within 30 min. Immunohistochemical test with this antiserum showed that Lrg was a cytoplasmic protein and rabbit antiserum against human Lrg protein could be used in eukaryotic cell and normal tissues. CONCLUSION: The immune serum specific against Lrg is obtained， which can be used in normal tissues and cells.
【Keywords】 lrg; affinity purification; immune sera
【摘要】 目的： 在大肠杆菌表达人lrg，制备鉴定人Lrg免疫血清. 方法： 构建pcTATlrg重组表达质粒，并在大肠杆菌中诱导表达相应的融合蛋白；对表达的融合蛋白采用镍柱和SDSPAGE纯化；以纯化蛋白作为免疫抗原，对新西兰白兔实施多次免疫（间隔时间分别为1 mo， 3 wk， 2 wk）. 结果： 获得兔抗人Lrg免疫血清. 经过ELISA和Western Blot检测，效价在1∶1000以上. 真核细胞实验表明，6HisTATLrg蛋白具有良好的穿透性，可以在30 min内从培养液进入细胞质; 免疫组化实验表明Lrg是一种胞质蛋白; 兔抗人Lrg免疫血清可有效应用于细胞和组织的检测. 结论： 制备得到兔抗人Lrg免疫血清，为lrg的功能研究打下基础.
【关键词】 人lrg基因；亲和纯化；免疫血清
0引言
人lrg基因是一种脂多糖应答基因. 系采用基于PCR的改良消减杂交技术［1］，用脂多糖刺激人牙髓细胞， 克隆得到并登陆GenBank的新基因［2，3］， 具体功能还不清楚. 生物信息学分析表明，人lrg基因的开放读框约558 bp， 预计编码的蛋白质包含186个氨基酸；编码的序列中包含2个相互重叠的亮氨酸拉链结构和1个螺旋-转角-螺旋结构［3］， 而亮氨酸拉链结构是DNA结合蛋白的特征性结构. 因此，对人lrg基因的研究既有线索可寻，又可以采用一些较新的方法［4］，来加快研究进度. 而深入研究Lrg在体内组织细胞分布特点及其功能，需要高效价的Lrg抗体. 为此，我们在大肠杆菌中融合表达了人Lrg蛋白， 并对6HisTATLrg初步纯化. 用纯化后的蛋白，免疫新西兰大白兔， 以获得高效价的抗Lrg血清.
1材料和方法
1.1材料
重组质粒pUC19lrg由本室构建［3］; BL21(DE3) 菌种和 pcTAT载体由本室保存. DNA marker DL2000购于TaKaLa 公司. PCR引物由上海博雅公司合成. 成年雄性新西兰大白兔1只(1.2 kg)由第四军医大学实验动物中心提供. HRP标记的羊抗兔二抗购自Santa Cruz Biotechnology; DAB，NBT/BCIP 由Sigma公司提供. SABCFITC、免疫组化检测试剂盒由武汉博士德公司提供.
1.2方法
1.2.1人lrg的扩增和克隆PCR反应体系中上下游引物P1，P2各20 pmol， 上游引物P1为AAGGTACCATGAAACAGCAAGAAGTACAAC，含有KpnⅠ酶切位点; 下游引物P2为AACTCGAGCACATCAAGGAACCATCGTC，含有XhoⅠ酶切位点. 模板pUC19lrg 0.02 μg ， 10×PCR buffer 5 μL， 10 mmol/L dNTP 1 μL， pfu polymerase 34 nkat. PCR反应参数为95℃ 变性15 s， 56℃ 退火40 s，72℃ 延伸40 s，共30个循环.
1.2.2人lrg原核表达载体的构建利用PCR产物纯化试剂盒对上述PCR产物进行纯化. 纯化的扩增产物用KpnⅠ， XhoⅠ进行双酶切，pcTAT载体进行同样的双酶切. 16℃连接目的基因与载体片段， 转化感受态细胞， 挑克隆， 提取质粒， 进行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定.
1.2.3人Lrg融合蛋白的表达纯化和免疫血清的制备pcTATlrg 转化入BL21(DE3)感受态细胞， 用200 mL LB(Amp+)培养， 1 mmol IPTG 诱导4 h， 收集细菌. 120 g/L SDSPAGE分析. 用Ni柱对超声裂解诱导细菌上清进行纯化， 120 g/L SDSPAGE分析. 并用SDSPAGE分离纯化后的融合蛋白. 将切下的目的蛋白条带研碎，溶于生理盐水. 采用背部皮下多点注射，免疫新西兰大白兔(以下同)， 1 mo后加强免疫. 3 wk重新加强免疫. 2 wk后再强化1次. 于第4次加强免疫后7 d取兔血清.
1.2.4ELISA 检测免疫血清的效价［5］初步纯化的6HisTATLrg蛋白包被ELISA板， 间接ELISA法检测兔抗人Lrg免疫血清的效价. 一抗为1∶1000兔抗人Lrg免疫血清(对照组使用未免疫兔血清); 二抗为1∶2000 HRP标记的羊抗兔IgG ; TMB显色，BioRad自动酶标仪测定.
1.2.5Western Blot 检测免疫血清效价［6］初步纯化的6HisTATLrg融合蛋白进行SDSPAGE分离，电转移法将相应蛋白转移到硝酸纤维素滤膜上，用10 mL 50 g/L的脱脂奶粉封闭. 一抗为1∶1000兔抗人Lrg免疫血清(对照组使用未免疫兔血清)，二抗为1∶5000碱性磷酸标记的羊抗兔IgG， 显色试剂为NBT/BCIP.
1.2.6SABCFITC染色检测免疫血清的效果爬片培养牙乳头细胞，将初步纯化的6HisTATLrg融合蛋白加入到培养液中. 30 min后取出细胞爬片， PBS洗涤， 多聚甲醛固定、正常山羊血清封闭， 分别加入1∶1000兔抗人Lrg免疫血清(对照组使用未免疫兔血清)、1∶2000生物素化的羊抗兔IgG， 荧光素染料SABCFITC， 奥林巴斯荧光显微镜观察.
1.2.7免疫组化检测免疫血清的效果对人睾丸组织进行常规石蜡切片，用免疫组化检测试剂盒进行染色. 一抗为稀释度1∶1000的兔抗人Lrg免疫血清; 二抗为1∶3000稀释的羊抗兔IgG. 未免疫兔血清作为阴性对照. DAB显色，常规脱水，透明，中性树脂封片.
2结果
2.1人lrg的扩增和克隆以pUC19lrg为模板，利用设计的引物PCR扩增lrg基因. 扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析，可见约1000 bp目的条带（Fig 1），与预期大小相符.
2.2人lrg原核表达载体的构建融合表达载体pcTATlrg进行KpnⅠ和XhoⅠ酶切鉴定. 酶切产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析，可见约1000 bp的目的条带（Fig 2），与预期大小相符.
2.3人Lrg融合蛋白的表达纯化和免疫血清制备经IPTG诱导的转化pcTATlrg细菌表现目的蛋白Mr 为25×103，占菌体蛋白总量的42%（Fig 3）. 经Ni柱纯化上清蛋白后，该目的蛋白占菌体蛋白总量的46%（Fig 3）. 将Ni柱纯化后的蛋白进行SDSPAGE二次纯化（Fig 4），切下相应的目的蛋白条带，生理盐水溶解，免疫新西兰白兔.
2.4ELISA检测免疫血清的效价酶标仪测量A280 nm值(平均数)为: 空白孔0.035， 1∶1000抗体孔0.177. 二者之比大于5，参考试剂盒规定，表明免疫新西兰大白兔所产生的免疫血清效价在1∶1000以上.
2.5Westernblot 检测免疫血清效价诱导后的细菌有预期大小 (Mr为25×103) 的特异性条带(Fig 5)， 同时未免疫兔血清没有表达相应的蛋白条带.
2.6SABCFITC染色检测免疫血清效果与对照组(Fig 6A)相比，加入6HisTATLrg融合蛋白的牙乳头细胞在胞质内呈现明显的绿色荧光(Fig 6B) . 表明6HisTATLrg融合蛋白在30 min内进入细胞，而本实验制备的免疫血清可有效应用于真核细胞的检测.
2.7免疫组化进行免疫血清的检测加未免疫兔血清的睾丸间质细胞胞质呈蓝色 (Fig 7A) ；加兔抗人Lrg免疫血清的睾丸间质细胞胞质内有棕黄色免疫反应阳性颗粒(Fig 7B). 说明Lrg蛋白位于正常睾丸组织睾丸间质细胞的胞质内.
近年来内毒素血症的研究在危重医学领域中十分活跃，对其发病机制的认识也在不断深入. 脂多糖（LPS）是一种内毒素，大量实验表明，LPS、脂多糖结合蛋白(LBP)和脂多糖受体系统(CD14)参与了炎症反应的病理生理过程［7］. LPS在细胞表面以LPSLBPCD14三体复合物的形式活化TLR4信号传导途径，通过一系列胞内分子的相互作用，产生炎性因子（如IL1，TNF等），导致炎症反应，甚至出现DIC和MOD［8］. LPS是机体炎症反应的重要触发剂， 因此，探讨LPS刺激后应答基因的功能，尤其是新发现基因的功能，研究其在LPS信号传导途径中的作用部位和作用性质，有助于阐明炎症发生的分子机制.
我们课题组自从成功克隆lrg基因并登录GenBank［1，3］以来，对该基因的功能展开了初步研究. 生物信息学分析表明，lrg基因编码的蛋白可能是一种DNA结合蛋白. 本课题组的前期实验表明，lrg基因作为一种LPS应答基因，会对真核细胞的细胞周期发生一定影响（资料待发表）. 尽管实验取得了一定进展，但该基因更多功能尚有待阐明. 利用课题组设计的引物，PCR得到了长1000 bp的产物，与预期大小相符. 该片段不仅包括了lrg基因的编码区，也包括了lrg基因下游的非编码区序列. 为了进一步研究lrg基因的功能，需获得针对Lrg蛋白的特异性抗体，本室采用初步纯化后的6HisTATLrg融合蛋白免疫新西兰大白兔，获得了兔抗人免疫血清. ELISA和Western Blot检测表明，其效价在1∶1000以上; 并且具有比较高的特异性.
我们采用的原核表达载体是pcTAT. 该载体采用T7启动子，带有6His的纯化标签以及HIVTAT部分基因序列. HIVTAT的部分基因序列编码11个氨基酸，可以快速穿过所有哺乳动物的细胞膜［9-11］；6His基因编码6个氨基酸. 本实验成功地将Lrg蛋白与6His纯化标签以及HIVTAT蛋白的基因进行了重组，获得了6HisTATLrg融合蛋白的基因. 重组基因编码的融合蛋白含216个氨基酸. 预计该蛋白Mr 为（20～26）×103. SDSPAGE表明，本研究表达的融合蛋白与预期大小相符. 通过蛋白融合，6HisTATLrg同样获得了快速穿膜特性，可在30 min内迅速从培养液穿过细胞膜到达牙乳头细胞的胞质. 这种快速穿膜特性对于研究该基因在真核细胞内的功能具有非常重要的意义. 我们采用NiNTA纯化系统［12］，专门用于纯化含有6His标签的重组蛋白，具有较高的纯化效率，初步纯化了Lrg蛋白. 初步实验表明，我们获得的纯化蛋白和免疫血清，纯度和产量足以应用于lrg的组织分布和功能研究. SABCFITC实验表明，在牙乳头细胞中，加入的Lrg蛋白在胞质中均匀分布. 而上述结果与免疫组化实验显示的Lrg在睾丸组织的分布结果一致，从而验证了实验结果的可靠性.
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