【Abstract】 AIM: To investigate the differentiation from mouse mesenchymal stem cell (MSCs) into cardiomyocyte progenitor. METHODS: MSCs were separated from mouse marrow and cultured and observed. To detect the surface antigens， the label cells were analyzed on a FAC scan flow cytometer. MSCs were induced with 5azacytidine which acted as a myoblast inducer. The induced MSCs were detected by RTPCR， electron microscope and immunofluorescence technique. RESULTS: The isolated subculturing MSCs displayed a fusiform celllike morphology. MSCs were uniformly positive for CD29 and CD44， but didn’t express CD34 and CD45. Through RTPCR analysis， induced MSCs expressed cardiomyocytespecific transcription factors (NKx25/Csx and GATA4) and fetal ventricular cardiomyocytespecific gene βmyosin heavy chain (βMHC)， but did not express adult ventricular cardiomyocytespecific genemyosin heavy chain (αMHC). Induced MSCs expressed αsarcomeric actin and desmin by immunofluorescence technique and myofilament formation was seen under electron microscope. CONCLUSION: MSCs can be induced to differentiate into cardiomyocyte progenitor.
【Keywords】 marrow mesenchymal stem cell; differentiation
【摘要】 目的：体外诱导小鼠骨髓基质干细胞（MSCs）向心肌细胞分化. 方法：MSCs通过细胞传代培养，并通过流式细胞仪进行鉴定. MSCs经过5杂氮胞苷诱导后，通过RTPCR， 透射电镜和免疫荧光技术检测诱导后的MSCs. 结果：培养的MSCs为形态学均一的梭形细胞，有时可见细胞融合. 流式细胞仪显示MSCs CD29，CD44表达阳性，CD34，CD45表达阴性. 经过5杂氮胞苷诱导后的MSCs表达Nkx25/Csx，GATA4，βMHC基因和αsarcomeric actin和desmin蛋白，透射电镜显示诱导后的MSCs有肌丝形成. 结论：经过5杂氮胞苷诱导后的MSCs可以向前体心肌细胞分化.
【关键词】 骨髓基质干细胞；分化
0引言
成年哺乳动物心肌细胞本身缺乏增殖分化能力，心肌细胞损伤坏死后必然由纤维组织替代，导致心脏的收缩舒张功能障碍. 细胞移植治疗缺血性心脏病是通过移植具有成肌潜能的各种干细胞至心梗区，使其在心肌梗死区增殖分化为肌组织，增加有功能的肌细胞数量，改善心功能. 骨髓基质干细胞(MSCs)是具有多种分化潜能的干细胞，具有巨大的功能可塑性，可以在新的微环境中生成新的组织所必需的细胞株，研究表明，MSCs可以在缺血心肌中分化为心肌细胞［1］. MSCs易于体外分离和体外培养，易于外源基因的导入和表达，另外骨髓再生能力强，易于反复获取，这使得MSCs成为细胞替代治疗心肌梗死的理想选择，具有重要的应用前景［2］. 我们通过体外培养、诱导MSCs，进一步验证了MSCs是具有向心肌细胞前体分化潜能的干细胞，并分析了MSCs诱导分化的机制.
1材料和方法
1.1材料
3~4 wk龄昆明种小鼠（第四军医大学实验动物中心），雌雄不限，DMEM低糖（Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青），Percoll细胞分离液（购自华美公司），5杂氮胞苷（Sigma公司），Trizol试剂、一步法RTPCR试剂盒（SuperscriptTM OneStep RTPCR with Platium Taq）（Invitrogen公司），引物Nkx25/Csx（同源异型盒基因216 bp），GATA4（锌指转录因子275 bp），βMHC（β肌球蛋白重链205 bp），αMHC（α肌球蛋白重链302 bp），DNA甲基转移酶（MTase 610 bp）由上海生工合成. FITC标记的羊抗大鼠IgG多克隆体（BD Biosciences公司），大鼠抗小鼠CD34 mAb（Hy biotechnology公司），大鼠抗小鼠CD29 mAb（BD Biosciences公司），大鼠抗小鼠CD45 mAb（Ebiosciences公司），大鼠抗小鼠CD44多克隆抗体（Ebiosciences公司）. ECL试剂盒(Amersham公司). 小鼠抗Desmin抗体、小鼠抗αsarcomeric actin抗体、FITC标记的二抗(羊抗小鼠IgG)、Cy3标记的二抗(羊抗小鼠IgG)购自武汉博士德公司.
1.2方法
1.2.1MSCs的分离、培养和诱导用21号针头注射器插入3~4 wk龄昆明种小鼠的股骨干，10 mL含200 mL/L胎牛血清的完全LDMEM（2 mmol/L L谷氨酰胺，10×104 u/L个青霉素和25 μg/L两性霉素）冲洗骨髓腔，60%的Percoll细胞分离液分离细胞，接种于25 cm2的培养瓶中. 37℃，50 mL/L CO2浮箱静置培养. 于接种5 d后进行第1次换液，将未贴壁的细胞全部弃掉，以后每周换两次培养液. 倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况，适时照相. 原代培养的细胞接近铺满整个培养瓶的表面时，即可用2.5 g/L胰酶将贴壁细胞消化分离（37℃， 3～5 min），然后按1∶2传代，并记为P1；传代培养过程中隔日换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满整个培养瓶的底面. 再重复以上操作，传代培养记为P2，余类推. 取生长状态良好的第二代MSCs加入8 μmol/L 5杂氮胞苷，培养24 h后更换培养液，继续培养3 wk和5 wk，培养方法同前.
1.2.2MSCs的鉴定取生长状态良好的第二代MSCs胰酶消化，PBS洗涤3次，分别加入荧光标记的抗体，4℃孵育30 min，PBS洗去未标记的抗体，10 g/L的多聚甲醛固定，应用ACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）检测细胞表面抗原表达.
1.2.3细胞RNA的提取及RTPCR反应取细胞数约3×106，加Trizol试剂1 mL提取总的RNA，应用Invitrogen生物技术公司的一步法RTPCR试剂盒进行RTPCR反应. 拟测量的PCR产物为：①Nkx25/Csx，预计扩增长度为：216 bp，正义引物为：5′CAGTGGAGCTGGACAAAGCC3′；反义引物为：5′TAGCGACGGTTCTGGAACCA3′；②GATA4，预计扩增长度为：275 bp，正义引物为：5′CTGACATCTCACTATGGGCA3′， 反义引物为：5′CCAAGTCCGAGCAGGAATTT3′；③βMHC，预计扩增长度为：205 bp， 正义引物为：5′GCCAACACCAACCTGTCCAAGTTC3′，反义引物为：5′TGCAAAGGCTCCAGGTCTGAGGGC3′；④αMHC， 预计扩增长度为：302 bp，正义引物为：5′GGAAGAGTGAGCGCCATCAAGG3′，反义引物为：5′CTGCTGGAGAGGTTATTCCTCG3′.
1.2.4间接免疫荧光染色步骤经5AZ诱导后5 wk的小鼠骨髓MSCs的细胞爬片以950 mL/L乙醇固定5~10 min，甩掉多余液体，加入10 g/L BSA封闭非特异结合位点，37℃孵育30 min. 加入小鼠抗desmin抗体、小鼠抗αsarcomeric actin抗体，置湿盒中4℃下孵育24 h， 0.01 mol/L PBS (pH 7.4)振洗3次，每次5 min. 加入FITC标记的二抗(羊抗小鼠IgG)（1∶200）、Cy3标记的二抗(羊抗小鼠IgG)（1∶200），37℃下孵育1 h. 免疫荧光专用缓冲甘油封片，即刻在荧光显微镜下观察照相.
1.2.5透射电镜观察5 g/L胰酶消化、收集MSCs和经5AZ诱导后6 wk的小鼠骨髓MSCs，于1.5 mL离心管中，40 g/L戊二醛固定24 h，常规超薄切片，透射电镜观察细胞外的基质形成情况及细胞的超微形态.
2结果
在原代培养的人骨髓MSCs中，多数为成纤维样的梭形细胞，偶有宽阔、平坦的多边形细胞，初始细胞呈团簇生长，向四周发散. 经传代培养后，造血细胞基本消失，贴壁细胞体积较大，均为一致的梭形细胞，有时可见细胞融合(Fig 1).
经抗CD44，CD29，CD34和CD45 mAb标记后检测结果为：细胞表面抗原抗CD29，CD44抗体为阳性，抗CD34，CD45抗体为阴性（Fig 2）.
通过RTPCR分析显示经过5杂氮胞苷诱导3 wk和5 wk的MSCs表达出心肌特异性的转录因子Nkx25/Csx和GATA4，同时表达出在胚胎期占优势的心肌细胞特异性的βMHC，没有表达处在成年期占优势的心肌细胞特异性的αMHC（Fig 3）.
经过免疫荧光检测证实5杂氮胞苷诱导后的MSCs表达αsarcomeric actin和desmin蛋白，说明诱导后的MSCs向成肌细胞分化（Fig 4）.
通过透射电镜还可以观察到诱导后的MSCs有明显的肌丝形成，并且可见到较多的糖原颗粒（Fig 5）.
3讨论
MSCs不同于骨髓中的造血干细胞，它们可以向间质细胞分化，1968年Friedenstein发现MSCs黏附在组织培养板上，类似成纤维细胞形态，以克隆方式生长. 多个种属包括人、大鼠、小鼠、兔和猴的MSCs均具有这些特性［3］. 本试验发现传代培养的MSCs为形态均一的梭形细胞，类似成纤维细胞，有时可见细胞融合.
骨髓来源的MSCs不能通过显微镜观察或者通过流式细胞仪来区分形态学的大小和细胞特征，MSCs的表面标志具有非单一特性，它表面具有50多种可检测的表面抗原，表达了间质细胞、内皮细胞的表面标志. 目前认为CD29， CD44， CD71， CD90， CD166， CD120a， CD124， Sh3及SH3是MSCs的重要标志. MSCs不表达造血细胞表面抗原，如造血前体细胞标志抗原CD34，白细胞标志抗原CD45，淋巴细胞表面抗原CD11a，单核细胞/巨噬细胞表面抗原CD14等，这说明MSCs为非造血细胞［4］. 本研究结果分析显示了相同的结果. MSCs已经被证明包含祖细胞能力可以多向分化为骨骼组织如骨骼、软骨、脂肪、肌腱、韧带和骨髓基质，这些新的发现不仅对于传统的干细胞生物是一种挑战，也意味着MSCs在临床上有着广泛的应用. 5杂氮胞苷是一种具有多种特异生物学性质的胞苷类似物，5杂氮胞苷可以通过非竞争性地结合到真核生物DNA上甲基转移酶的结合位点，并阻断甲基转移酶的活性，从而能选择性地活化真核生物的基因表达，诱导细胞分化，但其具体的作用机制目前尚不完全清楚［5］. 本试验用5杂氮胞苷诱导MSCs，通过免疫荧光染色方法和Westernblot检测方法显示诱导后的MSCs表达出肌小节肌动蛋白αsarcomeric actin［6］和横纹肌中间丝蛋白desmin［7］，通过透射电镜还可以观察到诱导后的MSCs有明显的肌丝形成，证明了MSCs可以向成肌细胞转化. 通过RTPCR分析显示经过5杂氮胞苷诱导后的MSCs表达出心肌特异性的转录因子Nkx25/Csx和GATA4［8］，同时表达出在胚胎期占优势的心肌细胞特异性的βMHC，没有表达处在成年期占优势的心肌细胞特异性的αMHC［9］，进一步说明MSCs可以向心肌细胞转化，但是分化的细胞是介于成熟的心肌细胞和心肌祖细胞之间的心肌细胞前体［10］. 本实验未诱导出跳动的心肌细胞可能是细胞克隆的特性不同所致，MSCs 生长以克隆形式生长，生长步骤在不同的克隆是不同的，因此诱导出结果不同［4］.
随着在干细胞研究中不断深入，人们发现一种组织的特异性干细胞可以横向分化成其他组织的细胞，而且干细胞的横向分化具有明显的普遍性. 另外由于胚胎干细胞供体不足，需长期免疫移植治疗，使其临床应用前景受到挑战. MSCs可以从成年骨髓中反复穿刺获得，而且MSCs容易体外培养，细胞增殖能力强，不需要加任何昂贵的细胞因子等优点使其成为进行细胞移植的理想的材料［1］. 本试验发现MSCs可以横向分化为成肌细胞，使得利用MSCs成为细胞移植治疗缺血性心脏病的主要来源成为可能.
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