作者： 谢华，何韶衡，迟秀丽，陈萍
【关键词】 哮喘
【Abstract】 AIM: To investigate the correlaitons and levels of tryptase， IL8， eotaxin and chymase activity in the plasma of patients with asthma. METHODS: A total of 60 patients with asthma at acute attack stage (30 severe and 30 moderate) were recruited into the study. IL8 and eotaxin levels were detected by sandwich ELISA procedures and tryptase levels were measured using antibody against tryptase with UniCAP system. The chymase activity was determined spectrophotometrically (410 nm) by the rate of hydrolysis of NsuccinylLAlaLAlaLProLPhepnitroanilide (SAAPP) 0.7 mmol/L in NaCl 1.5 mol/L and Tris 0.3 mol/L. The actions of protease inhibitors on chymase activities were examined with enzyme assay. RESULTS: At acute attack stage， the plasma levels of tryptase (2.8 μg/L) were higher than those of healthy subjects（1.2 μg/L）. The plasma levels of IL8 (141.5 μg/L) and eotaxin （154.9 μg/L）were significantly elevated in patients with asthma than those of healthy subjects（6.5 μg/L and 49.9 μg/L， respectively， P&<0.05）. The specific chymase activities of 18.3 % of patients with asthma［（109.9±132.0）nkat］ were higher than those of controls (0 nkat). The native protease inhibitors α1antitrypsin (α1AT) and soy bean trypsin inhibitor (SBTI) inhibited 87.0% and 88.2% chymase enzymatic activity， respectively. There were correlations between the levels of IL8 and eotaxin (r=0.4， P=0.046). There were no correlations between tryptase， IL8， eotaxin， neutrophils， lymphocytes， monocytes and eosinophils. CONCLUSION: Mast cells， neutrophils， eosinophils and cytokines participate in the pathogenesis of allergic inflammation. Among these cells， mast cells may play a key role as they can release mediators such as tryptase， chymase， IL8 or eotaxin which in turn recruit other inflammation cells including neutrophils and eosinophils to the involved areas.
【Keywords】 tryptase; chymasw; interleuking8; chemotactic factors， eosinophil; asthma
【摘要】 目的： 探讨哮喘患者血浆类胰蛋白酶（tryptase）、白介素8（IL8）、嗜酸性粒细胞趋化因子（eotaxin）水平和类糜蛋白酶(chymase)活性及相关性. 方法： 分别取健康人、哮喘急性期中度和重度患者各30例，静脉抽取抗凝血. 在UniCAP 100 全自动体外变应原检测仪上进行tryptase测定，采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验（SELISA）检测血浆IL8， eotaxin水平. Chymase活性测定：使用琥珀酰丙氨酸丙氨酸脯氨酸苯丙氨酸酰苯氨（SAAPP）做为底物，采用酶标仪在410 nm连续监测吸光度的变化. 结果： 急性期哮喘患者血浆tryptase (2.8 μg/L)值与对照组（1.2 μg/L）比较明显升高(P&<0.05)；IL8值（141.5 μg/L）显著高于对照组（6.5 μg/L）(P&<0.05)；Eotaxin值（154.9 μg/L）显著高于对照组（49.9 μg/L）(P&<0.05). 18.3 %的哮喘患者血浆chymase活性［（109.9±132.0） nkat］高于对照组（0 nkat），其活性可被类胰蛋白酶抑制剂SBTI和α1AT分别抑制87.0%和88.2%. IL8与Eotaxin之间存在弱相关性(r=0.4， P=0.046)；Tryptase， Eotaxin， IL8与血涂片中的嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞之间均无明显相关性. 结论： 肥大细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及其介质均参与中、重度哮喘的发生与发展过程. 其中，肥大细胞既可通过其分泌的介质如tryptase和chymase直接在哮喘的慢性气道炎症中起作用，也可分泌一些趋化因子如IL8，eotaxin等，通过募集嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等其它炎症细胞而间接起作用，肥大细胞在哮喘的发生与发展过程起重要作用.
【关键词】 类胰蛋白酶；类糜蛋白酶；白细胞介素8；趋化因子，嗜酸细胞；哮喘
0引言
支气管哮喘（哮喘）是许多细胞和细胞分泌成分参与的慢性炎症疾患，影响着大约10%的世界总人口. 在哮喘的慢性气道炎症中，参与的细胞有肥大细胞、嗜碱性粒细胞、T细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞及多种结构细胞（如上皮细胞，内皮细胞等）. 其中嗜酸性粒细胞在哮喘气道慢性炎症中的作用已被公认. 在重症哮喘患者中，研究发现气道黏膜中嗜酸性细胞明显减少，而中性粒细胞增多. 近来研究发现哮喘患者气道平滑肌束中肥大细胞数量增加并呈脱颗粒状态［1-3］. 以上三种细胞均在重度哮喘中起重要作用，但它们之间的相互关系尚不完全清楚. Tryptase和chymase是肥大细胞内特有的蛋白酶，在肥大细胞内含量丰富，是肥大细胞脱颗粒的标志物. 为探讨哮喘气道中炎症细胞及其细胞因子间的相互关系，我们对哮喘患者血浆中tryptase， IL8和嗜酸性粒细胞趋化因子（eotaxin）的水平及 chymase的活性进行了测量并对它们的相关性进行了分析.
1.1对象
急性期哮喘患者60例，其诊断及分组符合2003年中华医学会支气管哮喘防治指南［4］. 无合并呼吸系统其它疾病史，其中中度30例，重度30例. 正常对照组30例. 各组年龄、性别比较差异无显著性（P&>0.05）.
1.2方法
1.2.1血标本收集和处理分别取健康人、中度和重度急性期哮喘患者静脉血5 mL，立刻置入含EDTA的试管中混匀抗凝，静置30 min，1500 r/mim离心10 min，留取血浆冻存于-80 ℃待检.
1.2.2外周血有核细胞计数剩余血细胞进行涂片，室温下静置24 h，经瑞氏染色，显微镜下计数200个细胞进行细胞分类计数.
1.2.3IL8， eotaxin及tryptase测定采用SELISA分别测定血浆中 IL8， eotaxin 值. 试剂盒为美国PIERCE公司原装试剂盒. 敏感度为0.5 ng/L. 采用酶标仪（美国Molecular Devices 340PC型）以450 nm波长读盘. 在瑞典PHARMACIA公司生产的UniCAP 100全自动体外变应原检测仪上进行UniCAP Tryptase测定.
1.2.4Chymase活性测定采用酶标仪（英国Molecular Devices 340PC型），使用琥珀酰丙氨酸丙氨酸脯氨酸苯丙氨酸酰苯氨（SAAPP）作为底物（0.7 mmol/L），用96孔平板，反应体积为100 μL，含有0.3 mmol/L 的TrisHCL (pH 8.0)，加入样品开始反应，同时在410 nm连续监测吸光度的变化. 每个酶活力单位定义为25℃每分钟水解1 μmol/L底物所用的酶量. 标准品中chymase活性为166.7 nkat. 抑制剂实验： 在反应平板中分别加入黄豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI），α1抗胰蛋白酶 （α1AT）后再加入酶，最后加底物并立即监测吸光度的变化.
统计学处理： 数据用STATA7.0统计学软件包分析. 正态分布的数据均以x±s表示，并应用Students t test分析；非正态分布的数据用中位数(范围)表示，并应用KruskalWallis H检验进行组间差异分析. 各组数据间相关性的分析采用秩相关的方法进行，P&<0.05表示差异有统计学意义.
2结果
2.1中、重度哮喘患者和对照组肺功能情况哮喘患者肺功能FEV1，FEV1%和FEV1/FVC%均明显低于正常对照组(Tab 1).表1中、重度哮喘患者和对照组肺功能情况
2.2中、重度哮喘患者和对照组血浆Tryptase， IL8和eotaxin的测定急性期哮喘患者血浆tryptase中位数值为2.8 μg/L，中、重度哮喘组分别高出对照组（1.2 μg/L）约2.5和2.0倍；IL8值（141.5 μg/L）显著高于对照组（6.5 μg/L），中、重度哮喘组分别高出正常组20.0和22.8倍；eotaxin值（154.9 μg/L）显著高于对照组（49.9 μg/L），中、重度哮喘组分别高出正常组3.2和2.9倍(Tab 2).表2中、重度哮喘患者和健康对照血浆Tryptase， IL8 和 eotaxin的水平
2.3Chymase活性测定11/60（18.3 %）的哮喘患者血浆chymase活性［（110 ± 132 ）nkat］高于对照组（0 nkat），类胰蛋白酶抑制剂SBTI作用后为(7±14) nkat， α1AT为(7±16) nkat，即类胰蛋白酶抑制剂SBTI和α1AT分别抑制87.0 %和88.2%.
2.4相关性分析采用Spearman秩相关方法，eotaxin与IL8的r=0.41， P=0.0012，即IL8与eotaxin之间存在正相关性；tryptase与eotaxin和IL8之间无明显相关性，它们与血涂片中的嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞之间均无明显相关性，嗜中性粒细胞和淋巴细胞之间存在显著负相关（r=-0.95， P=0.0000）.
3讨论
近年来，关于肥大细胞在哮喘中作用的研究取得了一些新的进展，特别是逐渐认识到平滑肌细胞不仅仅是结构细胞，而且它还可分泌大量的炎症因子、可有增生反应、其表面表达黏附分子并可募集T 淋巴细胞等炎症细胞［1］. 与非哮喘患者相比，哮喘患者平滑肌中肥大细胞数量增加［2］，肥大细胞，而不是T细胞或嗜酸性粒细胞，局限化于哮喘患者支气管平滑肌束内，在健康人或嗜酸性粒细胞化支气管炎患者中则无此现象［1］. 肥大细胞是具有多种生物学功能的组织细胞，在免疫激活后，根据分泌的时间不同，能分泌一系列炎症性介质，包括IL8， eotaxin等［5］. tryptase能高效诱导嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞浸润［5］、持续性增加微血管通透性［6］、刺激上皮细胞释放IL8，上调细胞间黏附分子(ICAM1)的表达［7］、促进气道组织纤维化［8］，而炎症性细胞募集、血管通透性增加和ICAM1高表达［9］是哮喘炎症的主要特征，因此推测tryptase可能在哮喘炎症的发生、发展和气道重建中起促进作用. 本实验发现急性期中、重度哮喘患者血浆中tryptase值显著高于对照组，表明哮喘气道中存在肥大细胞脱颗粒过程.
IL8是气道活化上皮细胞和肥大细胞脱颗粒的一种分泌物质，是强效中性粒细胞趋化因子，可使嗜中性粒细胞在气道大量募集并激活，而活化的嗜中性粒细胞自身也产生 IL8，使嗜中性粒细胞进一步聚集，引起炎症的自身放大反应，加重气道炎症. 另外，活化的嗜中性粒细胞分泌的弹性蛋白酶等可使支气管上皮脱落、纤毛运动减少、刺激黏液分泌增加. 本实验发现，中、重度哮喘患者血 IL8值明显升高，说明 IL8 参与了哮喘的病理生理过程. Eotaxin是选择性嗜酸性粒细胞趋化因子，能诱导嗜酸性粒细胞在气道黏膜组织中募集［14］. 本实验显示中、重度哮喘患者血eotaxin值明显升高表明，在哮喘的发病过程中，肥大细胞激活，释放tryptase和eotaxin，可能引起气道局部的tryptase和eotaxin水平升高，进而促进嗜酸性粒细胞募集，嗜酸性粒细胞介质释放，引起气道炎症性破坏. tryptase、chymase与eotaxin之间无相关性表明，eotaxin的分泌可能不仅仅来自于肥大细胞，而eotaxin与IL8之间的相对较弱相关性则表明，这两种介质不完全是由一种细胞分泌，最大的可能性是eotaxin除来自于肥大细胞、上皮细胞外，还来自于巨噬细胞，而IL8 除来自于肥大细胞、上皮细胞外，还来自于嗜中性粒细胞.
参考文献
［1］ Bradding P. The role of the mast cell in asthma: A reassessment ［J］. Curr Opin Allergy Clin Immunol， 2003; 3(1): 45-50.
［2］ Page S， Ammit AJ， Black JL， et al. Human mast cell and airway smooth muscle cell interactions: Implications for asthma ［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2001; 281(6): L1313-1323.
［3］ Brightling CE， Bradding P， Symon FA， et al. Mastcell infiltration of airway smooth muscle in asthma ［J］. N Engl J Med， 2002; 346(22):1699-1705.
［4］ 中华医学会呼吸病学分会哮喘学组，支气管哮喘防治指南［J］. 中华结核和呼吸杂志， 2003; 26（3）: 132-138.
China Association for Science and Technology， The guideline of prevention and management for asthma ［J］. Chin J Tuberc Respir Dis， 2003; 26（3）: 132-138.
［5］ He S， Peng Q， Walls AF. Potent induction of a neutrophil and eosinophilrich infiltrate in vivo by human mast cell tryptase: Selective enhancement of eosinophil recruitment by histamine ［J］. J Immunol， 1997; 159: 6216-6225.
［6］ He S， Walls AF. Human mast cell tryptase: A potent stimulus of microvascular leakage and mast cell activation ［J］. Eur J Pharmacol， 1997; 382:89-97.
［7］ He S， Pearman LJ， Liu WL， et al. Mast cell tryptase can induce secretion of mucus from human bronchial tissue ［J］. Immunology， 1999;98(Suppl 1):111.
［8］ TunonDeLara JM， Berger P， Begueret H. Mast cells in the airway smooth muscle ［J］. N Engl J Med， 2002; 347:1040-1041.
［9］ 谢华，孙滨. 哮喘患者血清中可溶性细胞间黏附分子(sICAM1)表达和糖皮质激素治疗的影响［J］. 第四军医大学学报，1998；19（5）：585-586.
Xie H， Sun B. The level of ICAM1 in plasma of asthmatics and the effect of corticosteroid on it ［J］. J Fouth Mil Med Univ， 1998; 19(5): 584-585.
［10］ He S， Walls AF. The induction of a prolonged increase in microvascular permeability by human mast cell chymase ［J］. Eur J Pharmacol， 1998; 352: 91-98.
［11］ He S， Walls AF. Human mast cell chymase induces the accumulation of neutrophils， eosinophils and other inflammatory cells in vivo ［J］. Br J Pharmacol， 1998; 124: 1491-1500.
［12］ He S， Gaca MDA， McEuen AR， et al. Inhibitors of chymase as mast cell stabilizing agents: The contribution of chymase in the activation of human mast cells ［J］. J Pharmacol Exp Ther， 1999; 291: 517-523.
［13］ He S， Chen P， Chen HQ. Modulation of enzymatic activity of human mast cell tryptase and chymase by protease inhibitors ［J］. Acta Pharmacol Sin， 2003; 24:923-929.
［14］ 于化鹏，戚好文，陈新，等. 探讨过敏性哮喘中Eotaxin致气道炎症的机制［J］. 第四军医大学学报，2002；23（13）：1170-1173.
Yu HP， Qi HW， Chen X， et al. Role of eotaxin in airway inflammation of allergic asthma ［J］. J Fouth Mil Med Univ， 2002; 23(13): 1170-1173.