作者：王毅，宿晓云，王芳，于红，常淑芳，颜炜群
【关键词】 T淋巴细胞
【Abstract】 AIM: To study the induction of MUC1specific CTL in mice by peptide vaccine that was composed of mouse serum albumin and synthetic peptide DMUC1 with partial chirality. METHODS: The DMUC1 peptide containing DSer was synthesized with solid phase peptide synthesis， purified and coupled with mouse serum albumin. BALB/c mice were vaccinated by DMUC1 peptide vaccine and GMCSF or thymopeptide (TP). The abilities to stimulate the proliferation of lymphocytes and to induce the peptidespecific CTL were analyzed by 3HTdR incorporation and release assay， respectively. RESULTS: The molecular weight of the target peptide was confirmed by mass spectrum (MS) analysis. The DMUC1 peptide vaccine stimulated the proliferation of lymphocytes significantly. MUC1specific CTLs could be induced by DMUC1 peptide vaccine and these CTLs could kill the MUC1positive GZ.A5.3H.4 cells. CONCLUSION: The chiral DMUC1 peptide vaccine can induce MUC1specific CTL in mice， which provides some evidence for the treatment of tumors with synthetic DMUC1 peptide vaccine with partial chirality.
【Keywords】 MUC1; chiral; vaccines; TLymphocytes， cytotoxic
【摘要】 目的： 研究由具有局部手性特征的合成多肽DMUC1和小鼠血清白蛋白（mouse serum albumin，MSA）构成的多肽疫苗对小鼠MUC1特异性CTL的诱导作用. 方法： 用固相合成法合成含有DSer的多肽DMUC1，纯化后与载体蛋白MSA偶联，分别以细胞因子重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）和胸腺肽（TP）为佐剂，免疫BALB/c小鼠，测定淋巴细胞增殖活性、MUC1特异性CTL杀伤活性. 结果： 合成肽经HPLC纯化后，质谱分析证明目的肽的分子量与理论值相符；DMUC1多肽疫苗对BALB/c小鼠淋巴细胞增殖有明显的促进作用；DMUC1多肽疫苗诱导出的特异性CTL杀伤MUC1阳性肿瘤细胞GZ.A5.3H.4. 结论： 研究结果表明DMUC1合成肽疫苗可以在小鼠体内诱导出MUC1特异性CTL，为具有局部手性特征的MUC1合成肽疫苗进行肿瘤免疫治疗提供了实验依据.
【关键词】 MUC1；手性；疫苗；T淋巴细胞，细胞毒性
0引言
黏蛋白质（mucin1， MUC1）是一种高度糖基化的糖蛋白，在大多数肿瘤尤其是原发性和转移性乳腺癌中高度表达，并具有变异的糖基化位点. 主要表达于多种组织、器官中上皮细胞近管腔或腺腔面，呈顶端表达，极性分布. 在多种肿瘤中，MUC1异常高表达于整个细胞表面，糖基化不完全导致新糖链及肽链表位的出现［1］. MUC1与肿瘤的发生和发展密切相关，而其特有的结构和功能特点使其成为肿瘤免疫治疗的理想靶分子［2-4］. 有人［5， 6］证明，利用MoGMCSF（其主要活性成分是GMCSF）， QS21， MPL/DETOX等多种单一佐剂或复合佐剂配合MUC1KLH多肽疫苗，能够高效地诱导产生抗MUC1的IgG和IgM以及KLH特异性的淋巴细胞增殖活性和KLH特异性的IFNγ， IL4分泌，但是对淋巴细胞增殖活性无明显促进作用，也未能诱导出MUC1特异性的细胞免疫应答. 为了解决MUC1多肽疫苗免疫原性弱，体内半衰期短，难以在体内有效地诱导出特异性CTL的问题，我们以MUC1胞外段的连续重复序列（variable number of tandem repeats， VNTRs）为基础，在抗原决定簇（APDTRP）的两侧用D型丝氨酸进行残基替换，从而降低多种蛋白水解酶对它的酶切活性，延长其体内半衰期；与载体蛋白MSA偶联后，分别以细胞因子GMCSF、胸腺肽（TP）为佐剂，进行手性多肽疫苗诱导MUC1特异性CTL的实验研究.
1材料和方法
1．1材料
① 仪器及试剂： 多肽合成仪（美国ACT90），高效液相色谱仪（美国Waters 600E） ，激光解析电离飞行时间质谱仪（美国LDI1700）；NFmoc保护氨基酸，HOBt，FmocProCLTR树脂购自ACT公司；DIC，DIEA，TFA，哌啶，茴香硫醚，乙二硫醚，小鼠血清白蛋白，戊二醛购自Sigma公司；DMF，DCM，乙腈，甲醇，乙醚，苯酚购自Fisher公司；其余普通化学试剂均为国产分析纯. Fmoc氨基酸的侧链保护基为： Thr(But)，Asp(Obut)，His(Trt)，Ser(Trt). ② 细胞系： 小鼠乳腺癌细胞系GZ.A5.3H.4，种属来源：BALB/c，转染人MUC1全长cDNA，并高表达MUC1，由Biomira公司惠赠；采用含有100 mL/L新生小牛血清、600 mg/L G418的DMEM培养液，50 mL/L CO2， 37℃培养. ③ 动物： BALB/c小鼠： 雌性，6~8 wk龄，体质量（20±2）g，由长春生物制品所动物室提供.
1．2方法
1．2．1多肽疫苗的制备
1.2.1.1多肽合成① 称取FmocProCLTR(0.9 mmol) 树脂置于多肽合成仪反应瓶中，加入DCM充分溶涨30 min，滤去DCM；② 在盛有Fmoc保护氨基酸树脂的反应器中加入含有200 mL/L哌啶的DCM洗涤5 min，排空滤液；③ 再次加入含有200 mL/L哌啶的DCM，反应25 min，脱去Fmoc保护基；④ 用DMF洗涤，2 min×2次；⑤ 甲醇洗涤，2 min×1次；⑥ DMF洗涤，2 min×2次；⑦ 称取相当于树脂氨基的量3倍的保护氨基酸，DIC， HOBt和DIPEA加入反应器中，室温振摇反应1h；⑧ DMF洗涤，2 min×2次；⑨ 甲醇洗涤，2 min×1次；⑩ DMF洗涤，2 min×2次. 重复固相接肽步骤直至完成全部肽链（D MUC1）的合成，多肽链氨基酸序列如下：N′ProAlaHisGlyValThrDSerAlaProAspThrArgProAlaProGlyDSerThrAlaProC′
1.2.1.2多肽树脂的切割和侧链保护基的脱除肽链合成结束后，用切割试剂（TFA∶h3O∶苯酚∶乙二硫醚∶茴香硫醚=82.5∶5.0∶5.0∶2.5∶5.0）脱去侧链保护基团并切下树脂. 用预冷的无水乙醚沉淀多肽，-20℃放置1 h使沉淀完全. 离心，去除上层清液，用无水乙醚洗沉淀两次，通入N2气吹干沉淀，用适量无菌蒸馏水溶解后冷冻干燥，即得粗品肽.
1.2.1.3分离纯化粗品肽利用高效液相色谱法，采用C18分析柱（Waters NovaPak C18 3.9×150 mm）和C18半制备柱（Waters Prep NovaPak C18 7.8×300 mm）分离和纯化. 由1 mL/L TFA 乙腈溶液 和1 mL/L TFA水溶液构成二元梯度洗脱系统，在40 min内洗脱液中1 mL/L TFA 乙腈溶液的比例从0升到60%，检测波长为214 nm.
1.2.1.4质谱鉴定测定分子量，以确定合成、纯化产物为目的产物.
1.2.1.5合成肽与载体蛋白的连接利用戊二醛法将合成肽与小鼠血清白蛋白连接［7］.
1.2．2手性MUC1多肽疫苗免疫小鼠及MUC1特异性CTL的诱导BALB/c小鼠分为空白对照组、DMUC1多肽疫苗+ GMCSF组、GMCSF组、DMUC1多肽疫苗+胸腺肽（TP）组和TP组，每组10只. 空白对照组（control）： 每日ip生理盐水；DMUC1 +GMCSF组：背部皮下多点免疫DMUC1多肽疫苗（DMUC1多肽15 μg/只），隔周1次，共2次；同时给予ip GMCSF（300 ng/d）；GMCSF组： ip GMCSF（300 ng/d）；DMUC1 + TP组： 背部皮下多点免疫DMUC1多肽疫苗（DMUC1多肽15 μg/只），隔周1次，共2次；同时给予ip胸腺肽（0.4 mg/d）；TP组： ip胸腺肽（0.4 mg/d）.
1.2.2.1淋巴细胞增殖活性测定(3HTdR掺入法)［6］二次免疫1 wk后小鼠无菌取脾，用毛玻璃磨碎，用DMEM培养液调节细胞密度为2.5×109/L，加入96孔培养板，每孔0.1 mL （2.5×105/孔），实验孔中添加合成肽(终浓度5 mg/L和 10 mg/L)，每组设3个复孔，在37℃， 50 mL/L CO2条件下培养 4 d. 之后每孔加入37 kBq 3HTdR（50 μL），在37℃ ，50 mL/L CO2条件下培养 14 h， 用多头细胞收集器收集细胞于玻璃纤维膜上，烤干后放入含5 mL闪烁液的闪烁瓶中，在β液闪计数器上测定每杯样品cpm值. 将实验组和对照组三复孔各自平均cpm值，代入下面公式计算刺激指数SI.
SI=实验孔cpm均值〖〗对照孔cpm均值
1.2.2.2效应细胞的制备第2次免疫1 wk后取小鼠脾脏，分离淋巴细胞，调整细胞密度至 2×1010/L.
1.2.2.3靶细胞标记取体外传代处于对数生长期的GZ.A5.3H.4细胞1×106个悬于1 mL DMEM培养基中，加入3HTdR 1.85 MBq，于37℃水浴4 h后；用PBS液洗涤3次(每次1500 r/min离心5 min). 再用DMEM培养基调成2×108/L.
1.2.2.4CTL杀伤活性检测取已标记的靶细胞悬液50 μL(含1×104个细胞)按不同效靶比加入效应细胞(100∶1，50∶1，10∶1)100 μL，加入96孔培养板， 均设3复孔. 自发对照孔仅加入 靶细胞50 μL， 并补加100 μL DMEM. 在37℃， 50 mL/L CO2条件下培养14 h， 孵育结束后每孔加0.5 mg胰酶(50 μL)，37℃， 50 mL/L CO2孵育30 min. 用多头收集器将细胞收集于玻璃纤维滤膜，烤干后用液闪仪测定cpm.
杀伤活性（%）=1-实验组cpm〖〗自发释放对照孔cpm
统计学处理： 数据采用x±s表示，组间比较采用方差分析及Dunnett t检验，方差不齐则采用秩和检验.
2结果
2.1肽合成产物的纯化及鉴定色谱图(Fig 1)及质谱图(Fig 2)显示，保留时间为24.692 min的组分为目的产物，其分子离子峰为1886.5(M+1)，理论计算值为1885.5，结果表明合成产物为目的产物.
2.2DMUC1多肽对BALB/c小鼠淋巴细胞体外增殖活性的影响小鼠的淋巴细胞在体外经DMUC1肽（终浓度5 mg/L和 10 mg/L）连续刺激4 d，以未加肽刺激的作为对照，3HTDR掺入法测定其增殖活性. 结果表明(Tab 1)，与对照组相比，经不同剂量DMUC1多肽体外刺激后，DMUC1+GMCSF组、DMUC1+TP组小鼠的淋巴细胞增殖活性增高，特别是5 mg/L组作用更加明显（P&<0.05）.表1DMUC1对免疫后BALB/c小鼠淋巴细胞增殖活性的影响（略）
2.3小鼠特异性CTL杀伤活性的测定经DMUC1多肽疫苗免疫后，测定小鼠的淋巴细胞在体外对MUC1阳性肿瘤细胞GZ.A5.3H.4的杀伤活性. 从Tab 2可以看出用DMUC1+GMCSF组、DMUC1+TP组对小鼠进行免疫后，可以诱导出MUC1特异性的CTL，并显示出对MUC1阳性肿瘤细胞GZ.A5.3H.4的特异性杀伤活性；GMCSF组和TP组小鼠的淋巴细胞对MUC1阳性肿瘤细胞也有一定的杀伤作用，但杀伤比率低于疫苗组.
3讨论
MUC1的串联重复序列（variable number of tandem repeats， VNTRs）氨基酸组成为PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA，其中APDTRP是T细胞和B细胞共同识别的表位［8］. 在进行多肽合成时，为了尽可能地确保产物的光学纯度，我们在确保免疫表位APDTRP不变的前提下，将其氨基酸序列改变为PAHGVTSAPDTRPAPGSTAP（LMUC1），这样使得具有光学稳定性的脯氨酸（Pro）位于合成多肽的C和N末端，从而更好地确保这个合成多肽的光学纯度.
一般情况下，自然界中大多数蛋白质和酶类都是由L氨基酸构成的，而酶与底物蛋白之间的特异性结合就决定了L型酶类只能对由L氨基酸构成的蛋白质和肽类进行高效特异性酶解作用，对含有或由D氨基酸构成的蛋白质或肽类的酶解效果则大大降低. 有研究表明，根据此种特点设计合成的多种肽类药物由于大大增强的稳定性而在体内获得了较高的生物利用度［9］. Geysen等［10］的研究表明：含有D氨基酸或完全由D氨基酸构成的蛋白或多肽的抗原性及免疫原性有一定程度的增强. 因此，为了提高多肽疫苗在体内的半衰期，从而使其能够有效地诱导CTL，我们将合成多肽的T细胞表位APDTRP两侧的Ser用DSer进行替换，合成具有局部手性特征的多肽（DMUC1）. 此外，由于LSer 和DSer在立体结构上的不同，导致DMUC1多肽在局部上具有了手性特征，具有了不同与体内肿瘤细胞所表达的MUC1的结构特征，因此在一定程度上增加了免疫原性，使机体的免疫系统能够对它进行识别并激活免疫效应细胞.
为了进一步增强疫苗的免疫原性，我们分别采用细胞因子GMCSF， TP作为佐剂来激发单核细胞和巨噬细胞的活性，更好地完成抗原递呈作用，达到杀伤肿瘤细胞的目的. 结果显示DMUC1 +TP组和DMUC1+GMCSF组的淋巴细胞增殖都显著高于对照组，而且DMUC1 +TP组的结果好于DMUC1+GMCSF；但是DMUC1+GMCSF组的MUC1特异性CTL活性高于DMUC1 +TP组，其具体机制尚有待进一步实验研究.
本研究的淋巴细胞增殖实验和CTL杀伤活性测定结果表明，DMUC1多肽疫苗与GMCSF， TP等细胞因子佐剂共同免疫小鼠后，小鼠的淋巴细胞增殖活性明显高于空白对照组，并对表达MUC1的肿瘤细胞有特异性杀伤作用. 这些实验结果肯定了该实验设计的可行性和有效性，提示合成具有手性特征的多肽疫苗进行肿瘤的免疫治疗研究具有潜在价值.
参考文献
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