作者：滕勇，胡蕴玉，安书杰，戴先文，赵黎，白建萍，李旭升，吕荣
【关键词】 干细胞
【Abstract】 AIM: To build a method to culture bone marrowderived mesenchymal stem cells (MSCs) in vitro and to investigate the feasibility of inducing MSCs into osteoblasts. METHODS: Human MSCs were isolated from adult bone marrow and purified by percoll density gradient centrifugation and cultured in vitro. The MSCs attachment formed after 7-10 d and the MSCs of the passage 3 were chosen to induce into osteoblasts. Fifteen days later， the alkaline phosphatase assay was conducted using modified calciumcobalt staining method， type Ⅰ collagen and osteocalcin assay was conducted using immunohistochemistry and calcium node assay was done using alizarin red staining. RESULTS: Homogeneous MSCs were obtained by percoll density gradient centrifugation. The induced MSCs had typical appearance of osteoblasts. The rate of ALP expression was 81%， the expressions of collagen type Ⅰand osteocalcin were positive， and calcium nodes were seen. CONCLUSION: The MSCs can be separated from adult bone marrow and cultured in vitro， which can be induced into osteoblasts.
【Keywords】 bone marrow; stem cells; adult; tissue engineering; osteogenesis/drug effects
【摘要】 目的： 建立成人骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养的方法，并探讨定向诱导分化为成骨细胞的途径. 方法： 抽取成人骨髓，Percoll密度梯度离心法进行体外培养，贴壁细胞传代，取第3代细胞在培养基中添加成骨诱导剂地塞米松、β甘油磷酸、维生素C，培养15 d后，在倒置显微镜观察细胞形态，钙－钴法染色检测碱性磷酸酶（ALP）表达，免疫组化（SABC法）检测Ⅰ型胶原、骨钙素表达，茜素红染色检测钙结节形成. 结果： Percoll密度梯度离心法培养可获得均一的MSCs；诱导分化的MSCs呈典型的成骨细胞形态；ALP染色阳性率可达81%以上；Ⅰ型胶原、骨钙素表达阳性；茜素红染色见钙结节形成. 结论： 可以从成人骨髓中培养出MSCs，并可定向诱导分化为成骨细胞，可用作临床骨组织工程种子细胞.
【关键词】 骨髓，干细胞；成年人；组织工程；骨生成/药物作用
0引言
种子细胞、支架材料、生长因子是组织工程的三大要素，寻找合适的种子细胞是成功的重要因素［1］. 目前骨组织工程种子细胞主要有骨、骨膜、骨髓和其他非骨组织. 骨髓基质干细胞（marrow mesenchymal stem cells， MSCs）因其来源充足，取材方便安全，便于培养和基因修饰，增生活跃、多向分化及成骨能力确切［2-4］，从而受到广泛关注，具有广泛的应用前景. 自从Maniatopoulos等［5］1988年首次报道鼠MSCs经体外培养可形成钙化的骨样组织以来，从动物骨髓诱导分化成骨细胞已不困难，人们目前已能从胎儿骨髓中分离出MSCs. 成人骨髓中MSCs含量较少，能否分离、分离的方法如何是目前研究的方向. 本研究在动物实验基础上建立临床成人MSCs的培养和诱导成骨的方法，为组织工程走向临床作准备.
1材料和方法
1.1材料
骨髓取自5例骨科取髂骨患者，年龄分别为28， 30， 35，55， 60岁. 2例诊断脊柱滑脱；3例诊断四肢骨不连接. 5例均无代谢性骨病及结核，肝肾功能正常. 经知情同意，术中取髂骨前从髂后上棘抽取骨髓5 mL，吸入加有0.5 mL肝素的20 mL无菌注射器. 主要试剂: LDMEM低糖培养基、胰酶均为Gibco产品，胎牛血清为Hyclone产品，地塞米松、β甘油磷酸、维生素C均为Sigma产品，Percoll分离液Pharmacia产品. 兔抗人Ⅰ型胶原多克隆抗体及免疫组化（SABC法）检测试剂盒为中山生物技术有限公司产品，鼠抗人骨钙素mAb为体美国BD公司产品，50 mL一次性塑料培养瓶为美国Coster公司产品，噻唑蓝（MTT）为华美生物工程公司产品. 完全培养基组成： LDMEM加入10 mL/L胎牛血清，青、链霉素终浓度1667 μkat/L. 成骨诱导条件培养基： 完全培养基加地塞米松、β甘油磷酸、维生素C，终浓度分别为1×10-8 mol/L， 50 mg/L， 10 mmol/L.
1.2方法
1.2.1成人MSCs原代培养MSCs的分离 将抽取的骨髓加入装有5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）的离心管，吸管吹打混匀，800 r/min离心10 min，弃去上层7 mL脂滴及上清，剩余上清与细胞混匀，沿管壁缓慢滴加底部装有Percoll（体积质量1.073 kg/L）分离液的离心管中，900 g离心30 min，吸取界面云雾状白膜层，加入PBS， 800 r/min离心10 min洗涤2遍，计数. 2例55岁以上患者来源骨髓以4×107接种于50 mL培养瓶，另外3例以2×107接种于50 mL培养瓶. 5 d后半量换液，第7~10日见有较多贴壁细胞后全量换液，此后2~3 d换液1次，细胞90%汇合时2.5 g/L胰酶消化1∶3传代.
1.2.2成人MSCs向成骨细胞表型诱导取生长良好的第2代细胞，更换培养液为成骨条件培养液，培养14 d，以2×108/L接种于孔底预先铺好1 cm2经过酸处理过的细胞玻璃爬片的24板，36 h细胞完全贴壁后，取出玻片做以下处理： ① 40 g/L多聚甲醛固定20 min，Ⅰ型胶原和骨钙素免疫组化染色（SABC法），Ⅰ型胶原DAB显色，骨钙素荧光显色. ② 950 mL/L乙醇固定15 min，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）钙钴法染色，观察阳性细胞百分比： 随机抽取5张爬片，每张随机观察200个细胞，计算ALP染色阳性者并计算平均值和百分比. ③拟作钙结节染色的爬片，2×109/L 接种，24 h贴壁后继续条件培养液培养，1 wk左右细胞密集，有结节形成，40 g/L多聚甲醛固定20 min，饱和茜素红溶液染色.
1.2.3诱导培养对生长曲线、贴壁率的影响将生长良好的第2代细胞传代后，对照组用完全培养基，实验组用条件培养液培养，细胞长满瓶底消化后进行以下实验： ① 调整细胞密度为2×107/L，接种9块90孔培养板，2组/板，6孔/组，150 μL/孔. 继续完全培养液和条件培养液培养. 参照文献［6］，每24 h取出一板，用MTT比色实验测生长曲线. 以时间为横坐标，6孔吸光度的平均值为纵坐标，绘制生长曲线. ② 取底面积12 cm2的培养瓶，实验组与对照组各12个，接种细胞4×105/瓶. 每2 h取出1瓶，倒去培养液，胰酶消化，计数贴壁细胞，计算每个时间点的贴壁率（贴壁率＝已贴壁细胞数/接种细胞数×100%）. 以时间为横坐标，贴壁率为纵坐标，绘制曲线.
2结果
2.1倒置显微镜观察刚接种的细胞呈球形悬浮于培养液，并混有少量血细胞. 5 d后半量换液，骨髓中的外周血及造血干细胞等非贴壁细胞被除去，可见大量单核细胞，圆形、未完全贴壁；7~10 d可见单核细胞贴壁，变成梭形或多角形；10 d后逐渐增多并连接成片，形成多个成纤维样细胞集落；14~18 d细胞逐渐汇集，胰酶消化传代后细胞漩涡状生长，排列整齐，多呈长梭形或多角形，较薄、有突起，突起的数目及形态各不相同（Fig 1）.
细胞在完全培养液下，1∶3传代可以连续传代10代. 5代以前生长迅速，平均5d传代1次；6代以后增殖缓慢，7~8 d传代1次；至第9代，细胞生长缓慢，10 d长满瓶底，细胞伸展不良，胞体增大，胞质稀薄，折光性减弱，同时伴细胞崩解、死亡. 2例取自55岁以上患者骨髓培养的MSCs，贴壁时间比另外3例晚2~3 d，贴壁细胞数量较少，需要加大原代培养的细胞初始接种密度. 首次传代时间约为20~23 d，传4代以后细胞增殖缓慢.
2.2ALP钙钴法染色在使用条件培养液的细胞中，大部分成阳性反应，大多角形细胞呈强阳性，而梭形细胞染色略弱，采用网格法计数，阳性细胞占细胞总数的81%（Fig 2）.
2.3Ⅰ型胶原和骨钙素免疫组织化学检测经SABC法染色经过条件培养液诱导15 d的MSCs胞质分泌Ⅰ型胶原和骨钙素，染色阳性. 而未经诱导的对照组为阴性（Fig 3， 4）.
2.4茜素红钙结节染色MSCs经诱导，可形成钙结节，细胞密集部出现致密的、圆形红染 （Fig 5）.
2.5生长曲线细胞生长曲线见Fig 6. 根据公式TD=t×lg2×（lgNtlgN0）-1得出成人MSCs倍增时间37 h，成骨诱导后倍增时间41 h.
2.6贴壁率MSCs 24 h贴壁率可达82%（Fig 7）.
3讨论
MSCs的培养方法有全骨髓法和密度梯度离心法［7］. 全骨髓培养法是将抽取的骨髓不经任何处理加入培养基内进行培养，其中的外周血细胞和造血干细胞等可随着换液逐渐被清除；离心法利用骨髓中各种细胞的密度不同，通过密度梯度离心吸取单核细胞层进行培养，获得的细胞均一、纯度高，且视野清晰，便于早期观察. 全骨髓法培养单核细胞增殖快、贴壁早，约早于离心法2~3 d. 推测可能是全骨髓法保存了骨髓环境中的丰富的黏附分子和各种生长因子，而离心法可能去除了这些因子，并且分离液和长时间的常温操作对细胞有损伤. 本实验是为后期MSCs的永生化打基础，希望获得高纯度的MSCs，因此我们采用了密度梯度离心法.
我们的实验以成人骨髓为培养材料建立起成人MSCs的培养方法和成骨诱导途径，为组织工程的临床应用打下基础. 我们在体外分离培养的成人MSCs细胞，形态良好、增生活跃，并且可以诱导为成骨细胞，据本实验观察1 mL 40岁以下成人骨髓经3代培养后，贴壁细胞数可以达到5×106~1×107数量级，55岁以上则数量减少，但仍可培养诱导为成骨细胞. 显示在成人，甚至老年人同样可以获取骨髓MSCs［10］.
研究还发现，人MSCs经诱导生成的矿化结节是连续的，而鼠MSCs在同样条件下生成的矿化结节不连续，与未矿化细胞群分隔，这与Bellows等的研究结果一致［11］. 显示种属间差异在MSCs培养中不容忽视，对人的MSCs研究是组织工程进入临床必须的［12-14］.
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