作者：葛玉霞，段云友，阮骊韬，曹铁生，袁丽君，吕发勤，刘禧
【关键词】 过氧化物酶
【Abstract】 AIM: To investigate the effects of hyperhomocysteinemia HHCY on the function of endothelium by observing the changes of NO， ET and the activity of GSHPX and vascular cell adhesion molecule1 (VCAM1) in plasma of HHCY rabbits. METHODS: Eighteen New Zealand rabbits were randomized into methionine group（group B， n=9）and control group (group A， n=9). Methionine group was fed with methioninerich diet of Lmethioine (0.8 g/kg per day) and normal control group was fed with normal diet. The levels of NO， GSHPX in plasma and the serum concentration of VCAM1 were measured at 20， 40， 60 and 80 d， and endothelium dependent dilation (EDD) and endothelium independent dilation (EID) were examined by high resolution ultrasound. RESULTS: In chronic hyperhomocysteinemia， the EDD of external iliac artery in methioine group was reduced significantly than that in control: 0 d， (15.3±2.6)%， 20 d， (5.1±1.7)%; 40 d， (2.7±1.0)%， 60 d， (-4.1±1.3)% and 80 d， (-5.5±1.3)% (P&<0.01). The EID in group B was reduced significantly compared with that in group A. The values of plasma in methioine group were markedly higher than those in the control group (P&<0.05) while the levels of NO were lower than those in the control. In methioine group， the serum concentration of VCAM1 was also significantly higher than that in the control group: 0 d， (0.066±0.003) μg/L， 20 d， (0.074±0.004) μg/L， 40 d， (0.078±0.008) μg/L， 60 d， (0.087±0.008) μg/L and 80 d， (0.098±0.010) μg/L (P&<0.01). CONCLUSION: Chronic hyperhomocysteinemia leads to endothelia dysfunction in rabbits. EDD is reduced through the inactivation of NO by homocysteinemia and the serum concentration of VCAM1 is elevated in hyperhomocysteinemia， which is related to the increased oxidative stress and decreased NO level.
【Keywords】 hyperhomocysteinemia/ultrasonography; nitric oxide; glutathione; peroxidase; vascular cell adhesion molecule1
【摘要】 目的： 通过观察高同型半胱氨酸血症（HHCY）时兔血浆一氧化氮（NO）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPX）和血管细胞黏附分子（VCAM1）的变化，探讨HHCY对内皮功能的影响作用. 方法： 新西兰白兔18只，随机分为L蛋氨酸M组（n=9）和对照N组（n=9）. 分别喂予添加3%的L蛋氨酸饲料和普通饲料，于0， 20， 40， 60和80 d检测其血浆中的NO， GSHPX及VCAM1的水平，同时利用高分辨力超声检测其髂外动脉的内皮依赖性舒张功能（EDD）、内皮非依赖性舒张功能（EID）. 结果： HHCY时，M组兔髂外动脉的EDD较对照组显著降低， 0 d (15.3±2.6)%；20 d(5.1±1.7)%；40 d (2.7±1.0)%；60 d(-4.1±1.3)%；80 d(-5.5±1.3)%;(P&<0.01)，M组的EID亦较对照组明显降低（P&<0.05）. 其血浆中NO和GSHPX亦较对照组明显降低(P&<0.05)，而血清中VCAM1较对照组明显升高， 0 d（0.066±0.003 ）μg/L； 20 d (0.074±0.004) μg/L；40 d (0.078±0.008) μg/L；60 d (0.087±0.008) μg/L；80 d (0.098±0.010) μg/L; (P&<0.01). 结论： 慢性HHCY兔血浆NO， GSHPX活性显著下降，并使VCAM1的浓度明显升高，与机体氧化应激增强作用有关.
【关键词】 高同种半胱氨酸血症/超声检查; 一氧化氮; 谷胱甘肽；过氧化物酶; 血管细胞黏附分子1
0引言
高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia， HHCY）被公认是一种导致动脉粥样硬化的独立危险因素，大量的研究发现蛋氨酸负荷后HHCY血管内皮依赖性舒张功能下降［1］， 同型半胱氨酸可通过氧化应激在动脉粥样硬化过程中发挥作用. 血管细胞黏附分子（VCAM1）能促进白细胞与血管内皮细胞的黏附及相互作用，是动脉粥样硬化早期的促发因素. 国内关于同型半胱氨酸与黏附分子的在体研究尚未见报道，我们旨在通过观察HHCY时兔血浆一氧化氮（NO）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPX）和VCAM1的变化，探讨HHCY导致内皮功能损伤的机制.
1材料和方法
1.1材料
新西兰白兔18只，雌雄不限，体质量2.0~2.5 kg. 兔龄4~5 mo，单笼饲养，由第四军医大学实验动物中心提供. L蛋氨酸购自味の素株式会社，（日本）NO和GSHPX试剂盒购自南京建成生物工程研究所，VCAM1试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司. 实验器材： 美国Acuson公司Sequoia512型彩色电脑声像仪，酶标仪为华东电子管厂产品.
1.2方法
1.2.1高同型半胱氨酸动物模型制备将新西兰白兔18只随机分为L蛋氨酸M组和对照N组2组，每组9只，N组动物给予进食等量普通饲料. M组动物给予等量普通饲料中每日添加3 g/L的L蛋氨酸. 分别于0， 20， 40， 60和80 d兔耳缘静脉取血2 mL，室温下3000 r/min离心15 min，取血浆-20℃冰箱冻存，用于检测血浆NO， GSHPX活力和VCAM1浓度.
1.2.2血浆NO浓度检测按试剂盒要求操作，设空白管（不加标本和亚硝酸钠），标准管（加20 μmol/L亚硝酸钠）和测定管内加0.3 mL待测血清，各管混匀放置10 min，3500~4000 r/min离心10 min，取上清液0.8 mL，加入显色剂0.4 mL混匀，15 min后测其吸光度值，在标准曲线（提前制成亚硝酸钠系列溶液）上查找相应的NO浓度.
1.2.3血浆GSHPX活力检测血样的准备与NO测量相同，严格按试剂盒步骤操作，按下列公式计算GSHPX活力. GSHPX活力单位=非酶管A值-酶管A值/标准管A值-空白管A值×标准液浓度（20 μmol/L）×稀释倍数(4.75).
1.2.4血浆VCAM1浓度检测采用双抗体夹心ABCELISA法，用抗兔VCAM1 mAb包被于酶标板上，标准品和样品中的VCAM1与mAb结合，加入生物素化的抗兔VCAM1，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的streptavidin与生物素结合，加入酶底物OPD出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，测A492 nm值，VCAM1浓度与A492 nm值成正比，可通过绘制标准曲线，求出标本中VCAM1浓度.
1.2.5高分辨力超声检测兔髂外动脉内皮舒张功能［2］选用7.0 MHz线阵探头，检测条件选“外周动脉”设置θ角为50°. 兔麻醉后仰面躺于兔台上，四肢外展，接心电图，记录心率，在心率稳定20 min后进行检测. 探头置于兔右侧腹股沟韧带中点内上方，首先二维显示髂外动脉（可上下移动探头，找到髂总动脉分叉后往下即为髂外动脉，若显示困难，可加用彩色寻找）. 至少获得2.0 cm以上的长轴切面，以心电图R波为准，测量髂外动脉管腔内膜面间的垂直距离，是为基态内径 (Fig 1)，然后用袖套式充气止血带，置于兔右下肢充气加压39.9 kPa，持续6 min，突然放松，在15~30 s内重复内径的测量是为加压后内径(Fig 2). 在兔休息至少15 min，然后舌下滴服硝酸甘油（500 μg）3 min，重复其内径的测量，是为含服硝酸甘油后内径.
内皮非依赖性舒张功能(EID)通过下面的公式计算：EID%=［(含服硝酸甘油后内径-基态内径)/基态内径］×100%
统计学处理: 所有计量资料均用x±s表示，利用SPSS软件采用重复测量设计的方差分析，P&<0.05为差别显著.
2结果
2.1慢性HHCY兔骼外动脉EDD的变化M组EDD在各测量时间点均较对照组明显降低(P&<0.01)，20 d即差异显著较大，EID也较对照组明显下降(P&<0.05). 但较EDD损伤出现时间延迟，到60 d才出现明显改变(Tab 1). 表1慢性HHCY兔髂外动脉EDD， EID的改变（略）
2.2慢性HHCY兔血浆中NO， GSHP X活性及s VCAM1定量检测M组兔血浆NO和GSHPX活性较对照组均明显降低(P&<0.05)，M组兔血清中VCAM1水平均比对照组升高(P&<0.01， Tab 2)(对照组的生化检测值是A值，考虑到节约经费以及生化测值的相对稳定性，故在以后各时间点均未重复检测).表2慢性HHCY兔血浆中NO， GSHPX血清中VCAM1的变化（略）
3讨论
正常的内皮细胞在各种化学物质和切应力作用下，通过一氧化氮合成酶(NOS)将L精氨酸转化为L胍氨酸，同时释放NO导致血管平滑肌细胞的扩张［3，4］. 本实验结果显示，给兔以高蛋氨酸饮食后，随着时间的推移，血浆NO明显降低，相应超声检测的内皮功能也明显受损，与以往的实验结果基本一致. 此外，血浆NO明显降低的同时，血浆GSHPX活性也明显下降. GSHPX是体内重要的抗氧化酶之一，能有效地清除超氧阴离子、自由基等，而起到保护细胞膜的作用. 因此我们认为HHCY不仅通过氧化应激导致NO的减少，而且还直接破坏抗氧化酶GSHPX的活性，降低机体对NO的保护，最终导致内皮功能的损伤.
VCAM1属免疫球蛋白超家族成员，在血管内皮细胞受损后表达增加，是促进内皮白细胞黏附的主要蛋白. 本研究显示，与对照组相比，HHCY时兔血浆NO水平明显降低(P&<0.05)而血浆VCAM1浓度却明显升高. NO是一种内皮源性的血管舒张因子，并且具有氧自由基清除以及抑制VCAM1表达的功能［5］. NO通过诱导NFkB胞质抑制物IkBα启动子的激活增强IkBα的转录［6］，或者通过清除氧自由基，阻抑IkBα的磷酸化和降解［7］，最终抑制NFkB活性，减少VCAM1基因转录及其表达. 而HHCY时，氧化应激增加，(O2-)生成增多，通过与NO结合形成过氧化亚硝酸阴离子(ONOO-)直接灭活NO，同时ONOO-使氧化低密度脂蛋白(OXLDL)生成增加，使内皮源性的NO合酶活性下降，使NO形成减少，抑制NFkB的表达能力下降，从而使VCAM1表达增强，故我们推测HHCY兔血清VCAM1升高与机体氧化应激增强及NO降低有关.
综上所述，本研究结果提示在HCY治疗中补充外源性的NO或使用抗氧化剂能够通过干预黏附分子途径来逆转和修复损伤的血管内皮功能，从而可预防或延缓动脉粥样硬化的发生、发展过程.
参考文献
［1］ Stuhlinger MC， Oka RK， Graf EE， et al. Endothelial dysfunction induced by hyperhomocysteinemia: Role of asymmetric dimethylarginine ［J］.Circulation， 2003;108(8): 933-938.
［2］ Celemajer DS， Sorensen KE， Gooch VM， et al. Noninvasive detection of endothelial dysfunction in children and adults at risk of atherosclerosis ［J］. Lancet， 1992;340(3):1111-1119.
［3］ Morita H， Kurihara H， Yoshida S， et al. Dietinduced hyperhomocysteinemia exacerbates neointima formation in rat carotid arteries after balloon injury ［J］. Circulation， 2001;103 (1) :133-139.
［4］ 阮骊韬，曹铁生，段云友， 等. 不同浓度的HCY对培养的人脐静脉内皮细胞NO及eNOS转录水平的影响［J］. 第四军医大学学报，2003;24(18):1697-1700.
Ruan LT， Cao TS， Duan YY， et al. Effects of HCY at different concentrations on NO and eNOS RTPCR in cultured HUVEC［J］. J Fourth Mil Med Univ， 2003;24(18):1697-1700.
［5］ Shimpo M， lkeda U， Maeda Y， et al. Effects of asprinlike drugs on nitric oxide synthesis in rat vascular smooth muscle cells［J］. Hypertension， 2000;35(5):1085-1091.
［6］ Pruefer D， Scalia R， Lefer AM， et al.Homocysteine provokes leukocyteendothelium interaction by downregulation of nitric oxide［J］.Gen Pharmacol， 2001;33(6):487-498.
［7］ Stangl V， Gunther C， Jarrin A， et al. Homocysteine inhibits TNFalphainduced endothelial molecule expression and moncocyte via nuclear factorkappaB dependent pathway ［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2001;83(2):338-344.